ФЕДЕРАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ЦЕНТР ЖИВОТНОВОДСТВА — 
ВИЖ ИМЕНИ АКАДЕМИКА Л.К. ЭРНСТА

ФГБНУ ФИЦ ВИЖ им. Л.К. Эрнста


Филиалы:  ВНИИГРЖ ВНИИФБиП Ладожский ИИБЖ ВНИИР
ВКонтакте Инстаграмyoutube

Отчет по проекту № 20-76-10006 (РНФ)

Отчет за 2020 год.

В настоящее время в России существует необходимость в получении качественно новых отечественных линий кур, обладающих заданными хозяйственно-полезными признаками. Для получения птиц с повышенным уровнем продуктивности необходим синтез методов работы с культурами клеток и современных наработок в области геномного редактирования и молекулярной генетики. Целью проекта являются научные разработки технологических подходов получения, культивирования и трансформации созданными векторами с системой CRISPR/Cas9 примордиальных половых клеток (PGCs) и их последующей трансплантации в эмбрионы кур с целью нокаутирования целевых генов для получения линии кур с заданными показателями продуктивности. В 2021 год нами был выполнен ряд задач, решение которых направлено на достижение конечной цели проекта.

1. Подобрана опытная группа кур и петухов пушкинской породы в половом соотношении 1♂:6♀. Оценен экстерьерный профиль выборки. Отобран биологический материал (кровь), выделена геномная ДНК.

2. На основании информации международной базы генетических данных NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov) проведен дизайн праймеров для секвенирования участков генов MSTN и G0S2 при помощи компьютерной программы BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).

3. Получены сиквенсы первичной последовательности целевых участков генов MSTN и G0S2 специфичные для экспериментальной выборки кур на генетическом анализаторе Applied Biosystems 3500.

4. Выявлены все потенциальные сайты для модификации системой CRISPR/Cas9 в последовательностях целевых генов MSTN и G0S2, рассчитана эффективность предполагаемой модификации (в зависимости от нуклеотидного состава направляющей РНК). Определены неспецифические сайты связывания (off-target), их количество и позиции в исследуемых участках генов. Проведен анализ рейтинга (score) для каждой направляющей РНК, показывающего количество потенциальных неспецифических сайтов.

5. Для решения задач проекта на базе ВНИИГРЖ в лаборатории молекулярной биологии был создан стерильный бокс для работы с культурой первичных половых клеток кур (PGCs).

6. Разработаны технологические подходы получения первичных половых клеток из куриных эмбрионов.

7. Экспериментальным путем определено оптимальное время и способ взятия PGCs кур (3-4 сутки инкубации из дорсальной аорты эмбрионов (стадия Hamburger Hamilton 14)).

8. По результатам комплексных исследований установлено положительное влияние на пролиферацию и рост PGCs клеток базовой среды KnockOut DMEM/F-12, без L-глутамина (Gibco, Thermo Fisher) с добавлением следующих компонентов в расчет на 500 мл среды (натрия пируват 1М (Applichem), нуклеозиды Embryo Max Nucleosides 100X (Millipore) - 2,5 мл, Human Activin A Recombinant Protein (Gibco, Thermo Fisher) - 25 нг/мкл, Human FGF-basic (FGF-2/bFGF) Recombinant Protein (Gibco, Thermo Fisher) – 10 нг/мкл, Chicken Serum (Gibco, Thermo Fisher) – 2%, 2-меркаптоэтанол (NF, VWR) - 3,9 мкл), антибиотик-антимикотик (Thermo Fisher) до 1Х.

9. Оценена пролиферация и морфология клеток на инвертированном микроскопе Olympus (модель: AHMT, Япония) с использованием программы TOP WIEW при увеличении х400. Подсчет клеток проводился с помощью камеры Горяева с использованием ПО (TOP WIEW). Клетки готовы к дальнейшим модификациям на 21 день культивирования.

Если заметили ошибку, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter

Контакты

142132, Московская область, Городской округ Подольск, поселок Дубровицы, дом 60
Тел. +7 (4967) 65-11-63
Факс: +7(4967) 65-11-01
E-mail: priemnaya-vij@mail.ruinfo@vij.ru

Copyrights

2005- © ФГБНУ ФИЦ ВИЖ им. Л.К. Эрнста
Все права защищены

Разработка и поддержка сайта:
Отдел научно-информационного обеспечения и международного сотрудничества

Яндекс.Метрика Рейтинг@Mail.ru