Отчет по проекту № 20-16-00106 (РНФ)

Отчет за 2020 год.

На начальном этапе отчетного периода была сформирована выборка, включающая более 1000 животных. Первичная оценка проводилась методами ветеринарной медицины. Животные были разбиты на три группы. В результате микробиомного анализа образцов, полученных от описанных выше групп животных, выявлено значительное доминирование нескольких операционных таксономических единиц. При переходе от отряда к семействам видно, что семейства Streptococcaceae, Staphylococcaceae и Bacillaceae возрастают у больных животных. Представители этих семейств описаны как основные возбудители воспалительных заболеваний КРС, в том числе мастита. При рассмотрении семейства Staphylococcaceae во всех группах доминирует патоген S. sciuri, в отдельных образцах с увеличением SCC (соматических клеток) возрастает содержание S. haemolyticus. S. epidermidis обнаружен в большинстве исследованных образцов и в некоторых случаях содержится на высоком уровне. В отдельных образцах молока обнаружен S. aureus. Кроме того, в нашем случае высокая доля бактерий семейства Aerococcaceae сохранялась во всех трех категориях, доля Planococcaceae понижалась в образцах, полученных от маститных коров и животных с субклинической формой мастита. Несколько необычным было и отсутствие E coli в молоке больных животных. Были обнаружены некоторые инфекционные агенты, характерные для летнего мастита. Мы показали, что в Центральной России мастит ассоциирован с широким спектром причинных организмов. Мы наблюдали некоторые различия в разнообразии двух исследованных ферм. Однако мы не обнаружили каких-либо существенных различий между здоровыми, маститными и субклиническими образцами по их статусу соматических клеток в молоке. Линейный дискриминантный анализ размера эффекта (LEfSe) подтвердил наличие нескольких индикаторных родов в хозяйствах Москвы и Тульской области. Эти результаты подтверждают сложную бактериальную этиологию мастита крупного рогатого скота. В рамках отчетного периода исследованы механизмы влияния энтеротоксинов rSEG, rSEI, rSEH (rSEs) стафилококка на эпителиальные клетки молочной железы. Оценивалось количество погибших клеток, а также находящихся в состоянии апоптоза и некроза. Для оценки жизнеспособности клеток bMECs мы использовали метод тройного окрашивания Hoechst 33342, пропидиум иодидом и флуорогенным субстратом каспазы 3/7 NucView 488. Показано, что rSEI вызывает некротические изменения в исследованных клетках. При этом, обработка rSEH приводила к появлению клеток в состоянии апоптоза. При действии rSEG не обнаружено достоверного увеличения в количестве клеток в состоянии некроза или апоптоза. Однако оценка общего количества погибших клеток показала что все три токсина оказывают цитотоксический эффект. Важно отметить, что при обработке клеток rSEG мы наблюдали большое количество клеточного дебриса, окрашенного Hoechst 33342. Этот факт свидетельствует о том, что к моменту регистрации сигнала после обработки rSEG, большая часть клеток могла уже погибнуть и фрагментироваться. Это предположение может объяснять столь малые изменения в количестве некротических и апоптотических клеток в случае инкубации с rSEG. Описанный дебрис наблюдался только в случае rSEG, что может свидетельствовать о его наибольшей токсичность. Таким образом, эти результаты показывают, что все три rSEs демонстрируют значительное цитотоксическое действие, приводя к индукции процессов апоптоза и некроза. Исследовано влияние энтеротоксинов стафилококков на развитие окислительного стресса в bMECs по общему уровню активных форм кислорода. Детекция проводилась с использованием флюоресцентного красителя DCFH2-DA. Результаты анализа позволяют предположить, что исследуемые токсины активно стимулируют генерацию активных радикалов, при этом rSEG проявляет наибольшую активность. Исследовано влияние энтеротоксинов стафилококка на уровень ионов кальция в цитозоле bMECs. Регистрировалась динамики изменения концентрации внутриклеточного кальция в клетках в присутствии rSEs с помощью флуоресцентного кальций-чувствительного зонда Fluo-3 AM. Наибольшая скорость роста внутриклеточной концентрации кальция показана для клеток, обработанных rSEG. В случае rSEI скорость роста незначительно возрастала относительно контроля. При обработке клеток rSEH не наблюдается эффекта. Для rSEG его действие на уровень кальция в bMECs было рассмотрено при различных концентраций токсина. Показано, что rSEG влияет на динамику изменения уровня кальция в клетке. При увеличении концентрации токсина выход сигнала на плато происходит быстрее, тогда как в случае контролей этого не наблюдается. Необратимое длительное повышение концентрации кальция является индуктором множества внутриклеточных сигнальных процессов, приводящих к гибели клеток. Для исследований, запланированных на следующие этапы проекта, был выделен набор моноклональных антител мыши, специфичных к энтеротоксинам стафилококков. Были проэкспрессированы и очищены рекомбинантные энтеротоксины, физико-химическими и иммунохимическими методами показана нативность вторичной структуры полученных токсинов. По итогам микробиологических исследований в общей сложности 546(48,23%) образцов молока и смывов были положительными на Staphylococcus spp. из которых 260 были положительными на St aureus, 14(1,24%) – на Escherichia coli, 594(52,47%) – на Pseudomonas aeruginosa. Бактерий рода Salmonella обнаружено не было. Все штаммы обладали различной антибиотикоустойчивостью По итогам анализа 16S рРНК в отобранных образцах преобладал S. Aureus.

Если заметили ошибку, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter

Контакты

142132, Московская область, Городской округ Подольск, поселок Дубровицы, дом 60
Тел. +7 (4967) 65-11-63
Факс: +7(4967) 65-11-01
E-mail: priemnaya-vij@mail.ruinfo@vij.ru

Copyrights

2005- © ФГБНУ ФИЦ ВИЖ им. Л.К. Эрнста
Все права защищены

Разработка и поддержка сайта:
Отдел научно-информационного обеспечения и международного сотрудничества