Отчет по проекту № 19-16-00009 (РНФ)

Отчет за 2019 год.

Проект направлен на решение проблемы длительной консервации (криоконсервация и лиофильная сушка) репродуктивных клеток с целью сохранения генетического разнообразия сельскохозяйственных птиц in vitro и дальнейшего их использования при создании новых селекционных форм с привлечением генофондных пород кур.

1. Подготовлены криоконсервированные образцы спермопродукции: смешанных и индивидуальных эякулятов (не менее 300 образцов) Выращено и пробонитировано по экстерьерным признакам экспериментальное поголовье кур (n=200 гол.) с возраста 1 суток до 115 дней, полученное от птицы БРК «Генетическая коллекция редких и исчезающих пород кур» ВНИИГРЖ. Проведена поэтапная оценка и отбор петухов по реакции на абдоминальный массаж с целью получения спермы в условиях индивидуально-клеточного содержания в возрасте 120-160 дней (n=70 гол.). Проведена индивидуальная оценка петухов по качеству нативного семени (n=50 гол.) в полевых условиях: объем (мл), концентрация (млрд/мл), активность (балл). Для дальнейших исследований по совершенствованию технологии замораживания и оттаивания семени сельскохозяйственных птиц, для изучения влияния породных и индивидуальных различий в криотолерантности семени петухов, для разработки технологии лиофилизации согласно планам проекта были подготовлены в течение 3 месяцев образцы семени петухов 10 генофондных пород - 1218 шт. (смешанных – 727 шт., индивидуальных - 491 шт.). Размах изменчивости активности сперматозоидов в нативном семени составил от 75% до 90%, изменчивость активности сперматозоидов в заморожено/оттаянном семени составила от 18% до 55%. Полученные данные также отражают межпородные и внутрипородные различия в криорезистентности репродуктивных клеток петухов.

2. Экспериментальные данные по оценке криотелерантности спермы петухов, полученной от 10 генофондных пород использованием метода Sperm Class Analyzer CASA system. Получены экспериментальные данные по оценке криотолерантности семени петухов по 10 генофондным породам (павловская золотистая, бентамка ситцевая, род-айланд, китайская шелковая, орловская ситцевая, фавероль, брама палевая, итальянская куропатчатая, кохинхин карликовый, чешская золотистая) с использование традиционных методов и с использованием CASA. В опыте использовались петухи (n=26) с высокой активностью сперматозоидов нативного семени от 75% до 95%. При оценке активности сперматозоидов обоими методами отмечено снижение активности в заморожено/оттаянном семени до 10-75% при визуальной оценке, и до 18-74% при использовании CASA. В 30% случаев визуальная оценка и оценка CASA не совпали. Получен ранговый коэффициент корреляции на уровне rs=0,56 (p <0,005) между показателями активности заморожено/оттаянной спермы, оцененной двумя методами, что указывает на существенные различия в результатах. Очевидно, что для получения достоверной информации по оценке криотолерантности семени целесообразно использование системы CASA, позволяющей оценить количество жизнеспособных и морфологически нормальных клеток, массовую подвижность и различные параметры движения, включая процент подвижных сперматозоидов. Использованная в исследовании программа CASA (ZooSperm-1.0) требовала большой ручной корректировки из-за несовершенства определения ею скорости движения сперматозоидов петухов, которая значительно превышает скорость движения сперматозоидов млекопитающих; существенных морфологических различий по форме и размеру спермиев по сравнению с млекопитающих. Требуется разработка компьютерной программы для работы с семенем птиц, учитывающей видоспецифичность. Тем не менее, очевидны значительные межпородные различия в криотолерантности семени, причины которых подлежат дальнейшему изучению.

3. Экспериментальные данные по апробации методики оценки функционального состояния сперматозоидов до и после криоконсервации с помощью метода связывания вителлинового слоя яйцеклетки in vitro. Апробирован метод Robertson (1997) определения фертильности сперматозоидов с использованием вителлиновой мембраны яйцеклеток виргинных кур. Произведена модификация апробированного метода с целью снижения временных и трудозатрат, а также снижения затрат на используемые реактивы. Впервые, в отличие от метода Robertson (1997): 1) мы не разделяли слои вителлиновой мембраны на внутренний и наружный, тем самым сократили временные затраты на подготовку образцов; 2) использовали для отмывания вителлиновой мембраны от остатков желтка охлажденную дистиллированную воду вместо среды Dulbecco; 3) взаимодействие сперматозоидов с внутренним слоем вителлиновой мембраны проводили на предметном стекле, а не в пробирке, при этом микроскопический анализ показал визуальное соответствие исходному методу. Метод оценки фертильности семени в нашей модификации позволяет оценить его функциональную полноценность и прогнозировать оплодотворяющую способность. Получены убедительные различия по количеству точек взаимодействия сперматозоидов и внутреннего слоя вителлиновой мембраны яйцеклетки кур при использовании нативного и заморожено/оттаянного семени, а также заморожено/оттаянного с визуально одинаковыми показателями активности сперматозоидов, но, вероятно, разной функциональной полноценностью (целостностью мембран сперматозоида, сохранностью акросомы). Всего для отработки метода было задействовано 20 образцов семени. Данный метод обладает неоспоримым преимуществом перед традиционным методом оценки функциональных качеств семени только по активности сперматозоидов. Становится очевидным, что показатель подвижности спермиев не является достаточным критерием для достоверного прогнозирования фертильности семени, поэтому необходима разработка методики комплексной оценки заморожено/оттаянного семени, объединяющей в себе целый ряд критериев. Модифицированный метод оценки функционального состояния сперматозоидов будет использован в дальнейшей работе над проектом.

4. Предложен состав экспериментальной среды для криоконсервации спермы петухов с использование дисахаридов естественного происхождения. Впервые получены экспериментальные данные по использованию новой среды с дисахаридом естественного происхождения трегалозой для криоконсервации семени петухов. В процессе проведения исследования яйца кур ежедневно собирали в течение 9 дней, для контроля динамики снижения оплодотворенности дополнительно собирали яйца через 5,10 и 15 дней после последнего осеменения, всего проинкубировано 400 шт. для оценки оплодотворенности. Оплодотворенность яиц оценивали при вскрытии яиц после 6 суток инкубации. Оценка эмбрионального развития показала, что все эмбрионы соответствовали стандартам развития по Hamburger & Hamilton (1951), стадии 29-30; случаев ранней эмбриональной смертности отмечено не было. Показатели оплодотворенности яиц определялись по дням сбора с учетом периодичности осеменений в зависимости от состава криозащитной среды для разбавления семени петухов. Разработанная нами среда (опытная-1, опытная-2) для криоконсервации семени петухов обеспечивает значительно более высокие показатели оплодотворенности яиц 82% и 86% соответственно, по сравнению с обычно нами используемой средой ЛКС-1 (79%, контроль, разработка 1984 года). Полученные результаты оплодотворенности яиц при использовании заморожено/оттаянного семени превосходят средний мировой уровень, который по литературным данным не превышает 30% (Fulton, 2006). Особенно следует отметить увеличение продолжительности фертильности сперматозоидов в половых путях кур при использовании опытных сред. Даже на 12-й день после последнего осеменения оплодотворяемость яиц оставалась на приемлемом уровне 50-55% против 20% в контроле. Динамику функционального состояния сперматозоидов при использовании новых сред определяли по методу Bakst (2014). Было установлено, что функциональная полноценность заморожено/оттаянных спермиев и их переживаемость в половых путях курицы существенно различались в зависимости от состава используемой среды для криоконсервации. Количество точек взаимодействия сперматозоидов с вителлиновой мембраной яйцеклетки на 1см2 в группе контроля и опытных группах 1 и 2 на 4-й день после последнего осеменения составило соответственно 57 шт./см2, 300 шт./см2 и 500 шт./см2. На 15-й после последнего осеменения в контрольной группе наблюдалось отсутствие точек взаимодействия, а в опытных группах 1 и 2 оно составило 91 шт./см2 и 345 шт./см2 соответственно.

Отчет за 2020 год.

1. Получены экспериментальные данные для создания протокола технологического процесса лиофилизации семени петухов с учетом этапов.
1.1. Пробоподготовка (протокол замораживания семени петухов для последующей лиофолизации).
- Экспонирование нативного семени в разведении 1:1 разработанным разбавителем ЛКС-Т10 (2019г.) в течение 40 мин.
- Состав среды: из расчета на 100 мл дистиллированной воды: глутамат натрия 1,92 г, ацетат калия 0,5 г, поливинилпирролидон 0,3 г, сульфат протамина 0,032 г, фруктоза 0,72 г, трегалоза 0,166 г.
- Центрифугирование 1 мл нативного семени при 3 тыс. об./мин в течение 10 мин.
- Удаление надосадочной жидкости, конечный объем центрифугата составляет от 200 мкл до 300 мкл.
- Внесение 5 мкл концентрированного раствора трегалозы (0,015 г на 0,025 г разбавителя ЛКС-1) в целях сохранения целостности мембран сперматозоидов в каждый центрифугат. Проведение вторичного экспонирование в течение 10 мин.
- Внесение криопротектора диметилацетамида в конечной концентрации 6% и эквилибрация образца в течение 1 мин.
- Распределение семени на поверхности стенок стеклянного флакона и проведение замораживания в тонком слое в парах жидкого азота по методу Курбатова А.Д. и др. (1984).

1.2. Первичная сушка семени петухов в лиофильной сушилке TFD-8501 (ilShinbiobase Co. Ltd, Южная Корея).
- создана принципиальная экспериментальная модель устройства для поддержания необходимого низкотемпературного режима на пробах (от -150 град. в начале процесса до -50 град. при окончании) в условиях вакуума в процессе первичной лиофильной сушки;
- подобран экспериментальный режим первичной сушки семени петухов на установке TFD-8501 (ilShinbiobase Co. Ltd, Южная Корея): предварительное охлаждение конденсора до температуры -70,0°С; достижение режима рабочего вакуума после охлаждения конденсора ~13-14 мин; продолжительность первичной сушки в режиме рабочего вакуума (5 mTorr) - 2 часа.

1.3. Регидратация лиофилизированного образца.
- Экспериментальный состав среды для регидратации (из расчета на 100 мл дистиллированной воды: глутамат натрия 1,92 г, ацетат калия 0,5 г, поливинилпирролидон 0,3 г, сульфат протамина 0,032 г, фруктоза 0,8 г, несульфированный гликозаминогликан - гиалуроновая кислота 0,04г), позволяющий снижать степень агглютинации сперматозоидов.

2. Определены критерии качества семени петухов, необходимые для эффективного использования в технологическом процессе лиофилизации:
- объем эякулята (при необходимости сохранения индивидуальных эякулятов) не менее 0,8 мл;
- общая подвижность заморожено/оттаянного в гранулах семени не менее 30%;
- поврежденность мембран заморожено/оттаянных в гранулах сперматозоидов не более 50,0%;
- степень поврежденности хроматина заморожено/оттаянных в гранулах сперматозоидов не более 40,0%.

3. Впервые в мире проведены эксперименты по лиофилизации семени петухов.
- впервые доказана возможность сохранения морфологической целостности, в том числе кинетического аппарата, сперматозоида позвоночных животных в процессе лиофилизации;
- впервые получены результаты, доказывающие возможность сохранения фертильности сперматозоидов в процессе лиофилизации семени (по результатам искусственного осеменения виргинных кур регидратированным семенем получены данные о числе точек взаимодействия сперматозоидов с вителлиновой мембраной желтка яиц - до 37 шт/см2, получено одно оплодотворенное яйцо из 9 снесенных яиц, собранных за 1 день).

Если заметили ошибку, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter

Контакты

142132, Московская область, Городской округ Подольск, поселок Дубровицы, дом 60
Тел. +7 (4967) 65-11-63
Факс: +7(4967) 65-11-01
E-mail: priemnaya-vij@mail.ruinfo@vij.ru

Copyrights

2005- © ФГБНУ ФИЦ ВИЖ им. Л.К. Эрнста
Все права защищены

Разработка и поддержка сайта:
Отдел научно-информационного обеспечения и международного сотрудничества