Отчет по проекту № 19-16-00115 (РНФ)

Отчет за 2019 год.

Определена методология выделения внеклеточных везикул (EVs) из фолликулярной жидкости (ФЖ) коров, позволяющую получать фракцию Evs, представляющую в основном экзосомы (87,9%) и частично микровезикулы. Анализ данных трансмиссионной электронной микроскопии выделенных Evs выявил как единичные везикулы (размером 30-150 нм), так и везикулы агрегированные в сгустки. Протеомный анализ EVs из фолликулов 3-6 мм и соответствующих клеток гранулезы выявил 517 белковых изоформ, представляющих 362 белка. Часть белков были идентифицированы только в EVs (63 белка). В целом, данные протеомного анализа показали, что экзосомы из ФЖ коров могут происходить как за счет секреции клетками гранулезы, так и из кровообращения. Экзосомные белки могут быть вовлечены в различные метаболические процессы, включая трансляцию, биогенез рибонуклеопротеинового комплекса и биогенез рибосом. Гипотетически, рибосомные белки переносимые EVs, могут быть использованы для компактирования и / или разложения РНК или использованы для трансляции клетками-мишенями. Дополнительно представлены сравнительные данные экспрессии генов, кодирующих белки, идентифицированных в составе EVs, в фолликулярных клетках гранулезы, теки, кумулюса и ооцитов. На уровне мРНК были найдены данные экспрессии генов для 181 белка, обнаруженных в препарате внеклеточных везикул из ФЖ коров. Установлено, что большинство генов везикулярных белков экспрессируются соматическими клетками (гранулезы), и также специфично клетками кумулюса и теки. Около 20% генов экспрессируется ооцитом. Кроме того, проведен сравнительный анализ (по концентрации белка и размеру) EVs, выделенных из мелких (3-6 мм) и крупных (8-12 мм) фолликулов. Показано, что на 1 мл ФЖ из мелких фолликулов выделяется больше везикулярного белка, чем из больших фолликулов. Также выявлена разница в распределение размеров EVs в образцах из фолликулов соответствующих размеров. Установлено снижение процента экзосом размером до 50 нм в мелких фолликулах, и значительное возрастание микровезикул размером более 150 нм в фолликулах большего размера. Проведено моделирование условий трансвагинальной аспирации (Ovum pick-up - OPU), а также получены данные о влиянии кратности сессий OPU у животных-доноров на количество и качество получаемых ооцитов. Показано, что проведение процедуры ОPU c интервалом в 3 дня повышало выход морфологически нормальных ооцит-кумулюсных комплексов по сравнению с интервалом в 7 дней. Тем не менее, влияния кратности сессий OPU на долю созревания ооцитов, их дробление после in vitro оплодотворения и развитие до стадии бластоцисты, а также число ядер в эмбрионах выявлено не было. Сделан вывод, что смоделированный способ получения IVP эмбрионов в целом позволяет в условиях лаборатории получать эмбрионы, пригодные для дальнейшего использования (замораживания и/или трансплантации реципиентам).

Отчет за 2020 год.

Проведена оценка влияния внеклеточных везикул из фолликулов коров (FF-EVs) на качество ооцитов в процессе их созревания in vitro (IVM). Показано, что культивирование ооцитов в бессывороточной среде IVM при воздействии FF-EVs обусловливает необходимый уровень ядерного созревания в ооцитах, уменьшает частоту апоптотической дегенерации в созревших яйцеклетках, а также повышает их компетенцию к развитию до стадии поздней морулы/бластоцисты. Полученные результаты позволили сделать вывод о целесообразности применения системы созревания ооцитов коров, содержащей FF-EVs, для повышения эффективности получения IVP эмбрионов у крупного рогатого скота. В целях изучения возможных механизмов действия FF-EVs, проведен анализ инкорпорации фолликулярных FF-EVs в созревшие ооциты и окружающие их клетки кумулюса, посредством культивирования ооцит-кумулюсных комплексов (ОКК) в присутствии флуоресцентно-меченых FF-EVs. Микроскопический анализ показал наличие специфичной флуоресценции в клетках кумулюса, в оболочке ооцитов (zona pellucide) и в их цитоплазме, что свидетельствует о способности FF-EVs проникать как в ооциты, так и окружающими их соматические клетки в процессе совместной инкубации ОКК в культуре IVM (https://doi.org/10.3389/fvets.2020.584948). После in vitro оплодотворения ОКК видимые признаки присутствия поглощенных меченых FF-EVs сохранялись и на стадии зиготы. При дальнейшем развитии наличие специфичной флуоресценции обнаружено не было, в том числе и в раздробившихся ранних эмбрионах. В целях выявления активных молекулярных факторов, переносимых FF-Evs в овоциты, был проведен углубленный анализ данных белкового содержания FF-EVs. В соответствии с идентификацией белков по одному и более валидированым пептидам на каждый белок, всего в образцах, выделенных из FF-EVs, было выявлено 460 белковых изоформ, составляющих 326 белков, 193 из которых были также определены в клетках гранулезы. Впервые определен полный перечень белков, идентифицированных в FF-EVs и отмечены те, которые присутствуют также в клетках гранулезы и в ооцитах. Белки, идентифицированные в FF-EVs, были значительно более вовлечены в биологические процессы включая клеточную адгезию, опосредованную интегринами, активацию комплемента, трансляцию, регуляцию активности эндопептидаз и свертываемость белка. Среди молекулярных функций белков FF-EVs превалируют связывание рРНК, структурная составляющая рибосом, связывание кадгерина, участвующее в межклеточной коммуникации и связывание белков. FF-EVs были значительно обогащены белками, относящиеся к малым и большим субъединицам рибосом, а также к микрочастицам крови, люмену эндоплазматического ретикулума, межклеточноиу матриксу и разного рода мембранам. Анализ in silico данных РНК в FF-EVs показал, что только 18.3% белков имеют кодирующие их транскрипты в составе FF-EVs. Анализ наиболее репрезентативных GO биологических процессов, молекулярных функций и сигнальных путей выявил как различия, так и сходства белков и кодирующих транскриптов, переносимых FF-EVs. Оценена эффективность получения IVP эмбрионов крупного рогатого скота с использованием OPU-ооцитов (прижизненное получение методом Ovum Pick-up, OPU) после гормональной обработки животных-доноров или без нее (натуральный цикл). Показано повышающее влияние стимуляции на развитие оплодотворенных in vitro OPU-ооцитов до стадии бластоцисты и на качество полученных эмбрионов.

 

 
Если заметили ошибку, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter

Контакты

142132, Московская область, Городской округ Подольск, поселок Дубровицы, дом 60
Тел. +7 (4967) 65-11-63
Факс: +7(4967) 65-11-01
E-mail: priemnaya-vij@mail.ruinfo@vij.ru

Copyrights

2005- © ФГБНУ ФИЦ ВИЖ им. Л.К. Эрнста
Все права защищены

Разработка и поддержка сайта:
Отдел научно-информационного обеспечения и международного сотрудничества