Отчет к проекту № 18-316-20009 (РФФИ)

  1. За отчетный период выполнения работ по проекту, с целью сбора биологического материала и документации морфологических данных снежного барана, были организованы экспедиции на Центральное Верхоянье на верховье р. Барайы (в период с 01 августа 2019 г. по 23 августа 2019 г.) и Северное Верхоянье в Булунский район на Хараулахский хребет (в период с 30 июля 2019 г. по 13 августа 2019 г.). 
В результате проведённых работ, был произведён сбор биологического материала 8 образцов снежных баранов (6 образцов центрально-верхоянских и 2 образца хараулахских снежных баранов).
Кроме того, во время проведения экспедиций на Хараулархский хребет и Центральное Верхоянье были документированы морфологические данные отобранных образцов. Частично обработанные результаты по морфологии и по краниометрии снежных баранов за текущий год, выявили, что общая длина тела самцов центрально-верхоянских снежных баранов (n=6) варьирует в пределах от 142 до 157 см, составляя в среднем 149,5 см, длина тела самцов хараулахских снежных баранов (n=2) варьирует в пределах от 139 до 142 см, составляя в среднем 140,5 см. По общим размерам тела самцы центрально-верхоянских баранов ненамного крупнее хараулахских баранов и имеют близкие показатели с корякскими, но заметно мельче камчатских. Сравнительный анализ данных наших результатов с данными Чернявского (1964), Ревина и др. (1988) и Железнов-Чукотского (1994), показали, что самцы центрально-верхоянских толсторогов ненамного выше хараулахских толсторогов, но ниже в плечах, чем корякские и камчатские сородичи (доп. файл, табл. 1).
Краниометрическая характеристика выявила, что в отличие от камчатских баранов, якутские толстороги имеют достоверно меньшие костные стержни рогов, укороченную и более узкую морду, удлиненные носовые кости (Кривошапкин, Яковлев, 1999). По нашим предварительным данным, возможно есть различия между харулахскими и центрально-верхоянскими баранами, которые могут проявляться в размерах наибольшей ширине черепа и мастоидной ширине. Однако, достоверно об этом утверждать преждевременно, в связи с малым количеством черепов хараулахских баранов 10 и более лет (доп. файл, табл. 2).
За отчетный период выполнения исследований по проекту, в ходе выполнения экспедиционных работ в различные районы Якутии, было отобрано 152 образца волка, а также для изучения географической изменчивости линейных параметров волка исследованы туши волков.
Измерения линейных размеров частей тела центрально-якутских, центрально-верхоянских и арктических волков проводились у волков в возрасте от 2 лет и старше и представлены в таблице 3 (доп. файл). Проведенный анализ показал, что в каждой из групп довольно высокая вариабельность большинства показателей. Длина тела у арктических и центрально-верхоянских волков увеличивается по сравнению с центрально-якутскими. Такие показатели, как длина уха, длина ступни не различаются в изученных географических группах. Значение косой длины туловища и высоты в холке с передвижением на Север плавно увеличивается, при этом у арктических волков значение этого показателя намного выше, чем у центрально-якутских и центрально-верхоянских.
Арктические волки отличаются от центрально-якутских и центрально-верхоянских большими размерами, в том числе длиной тела, косой длиной туловища, длиной хвоста, и высотой в холке. Сравнивая полученные данные о размерах тела якутской популяции, можно отметить, что у данных волков длина ступни, высота уха, не отличаются, а хвост у самок короче.
Сравнительное исследование изменчивости параметров черепов полярных (арктических) и лесных волков (центрально-верхоянские, центрально-якутские) различных географических популяций, также проводились в пределах Якутии. Для изучения географической изменчивости параметров черепа исследовано 58 черепов взрослых полярных и лесных волков. Для сравнительного исследования в каждой популяции были сняты промеры черепов, добытых охотой взрослых волков. Установлено, что изменения размеров черепа волка носят адаптивный характер к условиям среды обитания. Известно, что параметры тела и краниологические показатели млекопитающих, согласно теории «клинальной географической изменчивости», имеют закономерную тенденцию снижения с севера на юг.
Результаты нашего морфологического обследования черепов лесных и полярных волков Якутии показали, что изменения параметров волка в целом хотя и соответствует общему правилу, однако имеет свои особенности (доп. файл, табл. 4). Установлено, что полярные (арктические) и лесные (центрально-верхоянские, центрально-якутские) волки Якутии по основным параметрам черепа слабо различимы. Достоверность различий по ним между волками различных географических регионов минимальная. Лишь по общей и кондилобазальной длине тундровые волки немного превосходят центрально-якутских и практически сходны с центрально-верхоянскими волками.
Кроме того, сравнительные исследования параметров черепа географических групп волков выявили, что центрально-верхоянские превосходят по всем параметрам черепа центрально-якутских.
За отчетный период выполнения работ по проекту, банк ДНК был пополнен 8 образцами снежного барана (6 образцов центрально-верхоянских и 2 образца хараулахских снежных баранов), а также 152 образцами полярных (арктические) и лесных (центрально-верхоянские, центрально-якутские) волков Якутии.
В связи с тем, что при проведении нами исследований гипервариабельного фрагмента митохондриального генома снежного барана (D-петли), к сожалению, были получены не интерпретируемые результаты, и принимая во внимание тот факт, что данный участок позволяет отследить лишь недавние эволюционные события в популяциях, нами было выполнено секвенирование гена цитохрома b (Cyt-b) не только якутского, но и других подвидов снежного барана. Кроме того, было выполнено сопоставление полученных результатов анализа гена цитохрома b снежного барана с данными митохондриального генома других представителей рода Ovis.
В общей сложности были получены секвенированные последовательности 87 образцов якутских, 9 образцов камчатских, 8 образцов корякских и 3 образца путоранских снежных баранов.
В качестве материала для исследования была использована мышечная ткань снежных баранов, представляющих различные подвиды: камчатский (KAM, n = 9), корякский (KOR, n = 8), путоранский (PUT, n = 3) и якутский (n = 87). Последний подвид был разделен на следующие группировки: Хараулахский хребет (Тикси) (TIK, n = 21), хребет Орулган (ORU, n = 25), центральное Верхоянье (VER, n = 23), хребты Сунтар-Хаята (SKH, n = 11), Момский (MOM, n = 7). В качестве групп сравнения были добавлены последовательности гена cytb мтДНК, североамериканских баранов, депонированных в базе данных GenBank NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov): барана Далла (O. dalli) (ODA, n = 3), толсторога скалистых гор (O. canadensis canadensis) (OCC, n = 8) и пустынного толсторога (O. canadensis nelsoni) (OCN, n = 11). Полный список использованных образцов из базы данных GenBank NCBI представлен в таблице 5 (доп. файл).
Выравнивание последовательностей мтДНК проводили с использованием алгоритма MUSCLE (Edgar, 2004) в программе MEGA 7.0.26 (Kumar и др., 2016). Для построения медианной сети гаплотипов (Bandelt, 1999) была использована программа PopART 1.7 (Leigh, Bryant, 2015). Для филогенетической реконструкции байесовским методом были отобраны по одному образцу, с наиболее часто встречающимся гаплотипом, из каждой популяции. Исключение составила группировка с хребта Орулган, представленная двумя образцами, относящимися к центральному Верхоянью – VER/ORU и к Хараулахскому хребту – TIK/ORU. Построение байесовского филогенетического дерева проводили с помощью программы MrBayes 3.2.6 (Ronquist, 2012) и последующей визуализацией в FigTree 1.4.2 (http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree). Определение лучших моделей эволюционных замен проводили отдельно для каждого нуклеотида в программе PartitionFinder 2 (Lanfear, 2017) с использованием информационного корректированного критерия Акаике (AICc) (Akaike, 1974). Наиболее оптимальными оказались эволюционные модели HKY+I, HKY и HKY+G, соответственно для первого, второго и третьего кодонов гена cytb. Расчеты показателей генетического разнообразия были проведены в программе Arlequin 3.5.2.2 (Excoffier, Lischer, 2010). Попарные генетические дистанции рассчитывались методом Tajima-Nei (Tajima, Nei, 1984), в программе MEGA 7.0.26. Далее на основе этих дистанций было построено филогенетичекое дерево по методу “сеть соседей” (Neighbor-Net) в программе SplitsTree 4.14.6.
В общей сложности у 107 образцов снежного барана было идентифицировано 19 гаплотипов. При этом у O. n. koriakorum и O. n. borealis, а также у популяции O. n. lydekkeri с Момского хребта было выявлено всего по одному гаплотипу. Из анализа полученной медианной сети (доп. файл, рис. 1.), следует, что наиболее обособленной и близкой к историческому предку современного снежного барана является группировка, населяющая горы Камчатки – O. n. nivicola, в которой было идентифицировано 5 гаплотипов. Все остальные образцы являлись производным одного гаплотипа, встречающегося в центральном Верхоянье – VER и на хребте Орулган – ORU. У образцов с Хараулахского хребта наблюдалось два гаплотипа, отличающихся между собой одной мутацией, один из которых также встречался у животных с хребта Орулган. Таким образом, наличие в ORU гаплотипов, отличающихся между собой четырьмя нуклеотидными заменами, подтверждает смешанное происхождение этой популяции, выявленное по результатам анализа SNP маркеров (Dotsev A.V., 2018). Был выявлен гипотетический гаплотип, связывающий популяцию с Хараулахского хребта с путоранским снежным бараном.
Аналогичная картина видна и при анализе байесовского филогенетического дерева (доп. файл, рис. 2.). Было показано, что два гаплотипа встречающиеся на Хараулахском хребте с высокой апостериорной вероятностью образуют один кластер. Их объединение в кластер с путоранским снежным бараном характеризовалось низкой апостериорной вероятностью – 0.67.
Эволюционные дистанции Tajima-Nei (доп. файл, рис. 3.), подтвердили, что камчатский снежный баран генетически наиболее удален от других исследованных группировок. Популяции якутского снежного барана с Центрального Верхоянья, хребтов Сунтар-Хаята и Момского имели схожие показатели генетических дистанций с популяциями с Хараулахского хребта и плато Путорана, соответственно – 0.005, 0.008, 0.005 и 0.005, 0.007, 0.006, и более низкие с корякской – 0.003, 0.005, 0.004. Учитывая дивергенцию хараулахской популяции снежного барана от других на уровне не ниже путоранского и корякского подвидов, по нашему мнению, эту популяцию следует рассматривать как отдельный подвид.
Показатели генетического разнообразия (доп. файл, табл. 6) в популяциях якутского снежного барана согласовались с данными полученными в исследовании, основанном на SNP маркерах. Так значения гаплотипического разнообразия (Hd) на Верхоянском хребте возрастали с севера на юг, от 0.381±0.101 у TIK до 0.746±0.098 у SKH. Наименьшие значения нуклеотидного разнообразия (π) и среднего числа нуклеотидных различий (K) также наблюдались у популяции снежного барана с Хараулахского хребта.
Тесты Таджимы и Фу, проведенные для выявления роли давления отбора на генетическое разнообразие, оказались статистически незначимыми во всех популяциях. Это свидетельствует о том, что все популяции не были подвержены влиянию естественного отбора и находятся в состоянии нейтрального равновесия.
В период выполнения работ по проекту, на основе анализа гена цитохрома b (Cyt-b), нами были проведены исследования времени расхождения (молекулярные часы) различных подвидов снежного барана.
В результате чего, с помощью программы BEAST, проведенный анализ времени дивергенции отдельных группировок снежного барана (доп. файл, рис. 4.) показал, что хараулахская популяция отделилась от якутского барана около 350 тысяч лет назад, и 250 тысяч лет назад от путоранского барана.
За отчетный период выполнения работ по проекту, с использованием чипа высокой плотности Illumina Ovine HD Beadchip, включающий в себя более 600 000 геномных вариантов и разработанного для домашних овец, нами впервые было проведено полногеномное исследование 24 индививдуумов снежного барана, образцы ткани которых, были отобраны в ходе экспедиционных исследований в географические точки Республики Саха (Якутия).
Геномную ДНК выделяли с помощью колонок Nexttec (“Nexttec Biotechnologie GmbH”, Германия) в соответствии с рекомендациями производителя. Скрининг SNP проводили с использованием биочипа Illumina Ovine HD Beadchip (Illumina Inc.”, CША), включающий в себя более 600 000 SNPs. Контроль качества SNP и статистический анализ полученных данных проводили с помощью программного обеспечения Plink 1.9. Контроль качества SNP включал в себя следующие критерии: исключение SNP, локализованных на половых хромосомах; исключение животных, в генотипе которых отсутствуют более чем 10% SNP от общего количества; исключение SNP при отсутствии в выборке локусов от общего уровня прогенотипированных более чем 10% (≥90%); исключение маркёров, не соответствующих критерию χ2 на равновесие в популяции по Харди–Вайнбергу (p ≤ 1 ⋅ 10–6); оценка качества генотипирования SNP по критериям GC Score (качество чтения SNP) не менее 0.5 (50%), по GT Score (уровень кластеризации SNP) не менее 0.3 (30%).
После проведения контроля качества осталось 13534 SNP. Данные SNP были локализованы на всех 26 аутосомах Ovis aries (доп файл, рис. 5). Наименьшее количество SNP наблюдалось на 26-й хромосоме – 252, а наибольшее на 1-й – 1498. В среднем на хромосому приходилось 520.5±61.2 полиморфных локусов. Также, был выполнен анализ распределения SNP в зависимости от частоты минорных аллелей (MAF), количество которых было распределено следующим образом: 0.1 – 5594, 0.2 – 2697, 0.3 – 1879, 0.4 – 1785, 0.5 – 1579 (доп. файл, рис. 6.).
Полученные результаты свидетельствуют не только о возможности использования данного чипа, но и более высокой информативности в сравнении с чипом средней плотности Ovine 50K SNP BeadChip (Illumina”, США): 13534 SNP против 1006 SNP.
Если заметили ошибку, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter

Контакты

142132, Московская область, Городской округ Подольск, поселок Дубровицы, дом 60
Тел. +7 (4967) 65-11-63
Факс: +7(4967) 65-11-01
E-mail: priemnaya-vij@mail.ruinfo@vij.ru

Copyrights

2005- © ФГБНУ ФИЦ ВИЖ им. Л.К. Эрнста
Все права защищены

Разработка и поддержка сайта:
Отдел научно-информационного обеспечения и международного сотрудничества