В настоящее время в России существует необходимость в получении качественно новых отечественных линий кур, обладающих заданными хозяйственно-полезными признаками. Для получения птиц с повышенным уровнем продуктивности необходим синтез методов работы с культурами клеток и современных наработок в области геномного редактирования и молекулярной генетики. Целью проекта являются научные разработки технологических подходов получения, культивирования и трансформации созданными векторами с системой CRISPR/Cas9 примордиальных половых клеток (PGCs) и их последующей трансплантации в эмбрионы кур с целью нокаутирования целевых генов для получения линии кур с заданными показателями продуктивности. В 2021 год нами был выполнен ряд задач, решение которых направлено на достижение конечной цели проекта.
1. Подобрана опытная группа кур и петухов пушкинской породы в половом соотношении 1♂:6♀. Оценен экстерьерный профиль выборки. Отобран биологический материал (кровь), выделена геномная ДНК.
2. На основании информации международной базы генетических данных NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov) проведен дизайн праймеров для секвенирования участков генов MSTN и G0S2 при помощи компьютерной программы BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
3. Получены сиквенсы первичной последовательности целевых участков генов MSTN и G0S2 специфичные для экспериментальной выборки кур на генетическом анализаторе Applied Biosystems 3500.
4. Выявлены все потенциальные сайты для модификации системой CRISPR/Cas9 в последовательностях целевых генов MSTN и G0S2, рассчитана эффективность предполагаемой модификации (в зависимости от нуклеотидного состава направляющей РНК). Определены неспецифические сайты связывания (off-target), их количество и позиции в исследуемых участках генов. Проведен анализ рейтинга (score) для каждой направляющей РНК, показывающего количество потенциальных неспецифических сайтов.
5. Для решения задач проекта на базе ВНИИГРЖ в лаборатории молекулярной биологии был создан стерильный бокс для работы с культурой первичных половых клеток кур (PGCs).
6. Разработаны технологические подходы получения первичных половых клеток из куриных эмбрионов.
7. Экспериментальным путем определено оптимальное время и способ взятия PGCs кур (3-4 сутки инкубации из дорсальной аорты эмбрионов (стадия Hamburger Hamilton 14)).
8. По результатам комплексных исследований установлено положительное влияние на пролиферацию и рост PGCs клеток базовой среды KnockOut DMEM/F-12, без L-глутамина (Gibco, Thermo Fisher) с добавлением следующих компонентов в расчет на 500 мл среды (натрия пируват 1М (Applichem), нуклеозиды Embryo Max Nucleosides 100X (Millipore) - 2,5 мл, Human Activin A Recombinant Protein (Gibco, Thermo Fisher) - 25 нг/мкл, Human FGF-basic (FGF-2/bFGF) Recombinant Protein (Gibco, Thermo Fisher) – 10 нг/мкл, Chicken Serum (Gibco, Thermo Fisher) – 2%, 2-меркаптоэтанол (NF, VWR) - 3,9 мкл), антибиотик-антимикотик (Thermo Fisher) до 1Х.
9. Оценена пролиферация и морфология клеток на инвертированном микроскопе Olympus (модель: AHMT, Япония) с использованием программы TOP WIEW при увеличении х400. Подсчет клеток проводился с помощью камеры Горяева с использованием ПО (TOP WIEW). Клетки готовы к дальнейшим модификациям на 21 день культивирования.
Отчет за 2021 год.
В результате работ по проекту в 2021-2022 гг. Были получены следующие результаты: 1. Создана генетическая конструкция на основе вектора pX330 (Addgene #442230) для нокаута гена MSTN в PGC кур пушкинской породы. Успешно клонированные плазмидные конструкции использовали для трансфекции полученных из 4-5 дневных эмбрионов кур пушкинской породы примордиальных половых клеток (PGC). Поскольку плазмида pX330 не имеет в своем составе репортерного гена GFP, то было принято решение использовать совместно с плазмидой pX330 плазмиду pEGFP-C1 (ООО «Биотехнология») для идентификации трансфицированных клеток с помощью детектирующего флуоресценцию микроскопа. Трансфекцию PGC плазмидными конструкциями проводили методом электропорации, используя Neon™ Transfection System («Invitrogen», США) Контроль флуоресценции в трансфицированных PGC клетках осуществлялся визуально на инвертированном микроскопе Olympus (модель: AHMT, Япония) на 3-4 день культивирования с использованием программы TOP VIEW при увеличении ×400 (объектив х40, окуляр х10). Трансфицированные клетки вводились в дорсальную аорту 5-дневных эмбрионов кур с помощью микроманипулятора Narishigi (Япония) иглой диаметром 30 мкм. Яйца после проведения микроинъекции отправляли на инкубацию при стандартных условиях температуры и влажности. Было проинъецировано 6 эмбрионов кур, из которых выжили 2 петуха и 2 курицы. По достижении половозрелого возраста у птицы (6 месяцев), для выделения геномной ДНК, взяли сперму у петухов и бластодиск из неоплодотворенных яиц кур. Выделенная ДНК была использована для ПЦР-амплификации локуса гена MSTN, содержащего целевые участки под выбранные нами гРНК (гидовая РНК). Полученные ПЦР продукты проанализировали с помощью секвенирования по Сэнгеру. В проанализированных образцах ДНК кур и петухов, прошедших на стадии эмбриона процедуру микроинъекции трансфицированными PGC пушкинской породы не выявлено изменений в нуклеотидной последовательности в исследуемом участке гена MSTN. 2. Создана генетическая конструкция на основе вектора pX458 (Addgene #48138) для нокаута гена MSTN и G0S2 в PGC кур пушкинской породы. Полученные культуры PGC кур пушкинской породы использовали для трансфекции созданными конструкциями для нокаута генов MSTN и G0S2. Систему редактирования вводили в PGC методом биобаллистической трансформации, используя генную пушку PDS-1000/HE SYSTEM (BIO-RAD, США). Трансфицированные клетки отбирали с помощью высокопроизводительного клеточного сортера S3e Cell Sorter (BIO-RAD, США). Согласно распределению клеток по интенсивности флуоресценции, эффективность трансфекции PGC посредством системы редактирования для нокаута генов MSTN и G0S2 составила 2,61 %. Трансфицированные PGC кур, отсортированные на сортере, использовали для выделения геномной ДНК с целью оценки эффективности редактирования генов MSTN и G0S2. 3. Этап создания системы редактирование генома на основе вектора FokI-dCas9, (Addgene #85756) для нокаута гена MSTN и G0S2 в PGC кур русской белой породы. В результате исследований в 2020-2021 гг. выявлено, что эмбрионы кур русской белой породы, более устойчивы к разного рода манипуляциям. И выживаемость у них выше на 50%. Мы ввели в 2021-2022 гг. в качестве экспериментального объекта в работу кур русской белой породы. Однако, гРНК подобранные для внесения изменений в целевой локус гена MSTN кур пушкинской породы оказались неподходящими, поскольку в результате секвенирования было выявлено два однонкулеотидных различия в пределах первых восьми ключевых нуклеотидов гРНК, специфичных для русской белой породы кур. Таким образом с помощью онлайн-инструмента CRISPOR (crispor.tefor.net) дополнительно был проведен дизайн направляющих последовательностей для внесения целевых модификаций в гены MSTN и G0S2 русской белой породы кур. 4. Получены данные экспрессии специфических эмбриональных генов развития, в том числе и транскрипционных факторов, подтверждающих присутствие PGC и развитие их в культуральной среде. Несмотря на то, что обработка бусульфаном по нескольким источникам должна вызывать повреждение ДНК в клетках-мишенях, что приводит к выключению всех клеточных механизмов и разрушению клеток, что должно останавливать рост PGC, уровни экспрессии специфических генов оставались достаточно высокими, особенно по гену PRDM1 и PIWIL2, DAZL1, но ниже чем у необработанных PGC, что может быть интерпретировано, как недостаточная концентрация или недостаточно длительное воздействие бусульфана на культуру клеток PGC. Данное явление требует дополнительных исcледований, поскольку противоречит общеизвестным данным.
