На начальном этапе отчетного периода была сформирована выборка, включающая более 1000 животных. Первичная оценка проводилась методами ветеринарной медицины. Животные были разбиты на три группы. В результате микробиомного анализа образцов, полученных от описанных выше групп животных, выявлено значительное доминирование нескольких операционных таксономических единиц. При переходе от отряда к семействам видно, что семейства Streptococcaceae, Staphylococcaceae и Bacillaceae возрастают у больных животных. Представители этих семейств описаны как основные возбудители воспалительных заболеваний КРС, в том числе мастита. При рассмотрении семейства Staphylococcaceae во всех группах доминирует патоген S. sciuri, в отдельных образцах с увеличением SCC (соматических клеток) возрастает содержание S. haemolyticus. S. epidermidis обнаружен в большинстве исследованных образцов и в некоторых случаях содержится на высоком уровне. В отдельных образцах молока обнаружен S. aureus. Кроме того, в нашем случае высокая доля бактерий семейства Aerococcaceae сохранялась во всех трех категориях, доля Planococcaceae понижалась в образцах, полученных от маститных коров и животных с субклинической формой мастита. Несколько необычным было и отсутствие E coli в молоке больных животных. Были обнаружены некоторые инфекционные агенты, характерные для летнего мастита. Мы показали, что в Центральной России мастит ассоциирован с широким спектром причинных организмов. Мы наблюдали некоторые различия в разнообразии двух исследованных ферм. Однако мы не обнаружили каких-либо существенных различий между здоровыми, маститными и субклиническими образцами по их статусу соматических клеток в молоке. Линейный дискриминантный анализ размера эффекта (LEfSe) подтвердил наличие нескольких индикаторных родов в хозяйствах Москвы и Тульской области. Эти результаты подтверждают сложную бактериальную этиологию мастита крупного рогатого скота. В рамках отчетного периода исследованы механизмы влияния энтеротоксинов rSEG, rSEI, rSEH (rSEs) стафилококка на эпителиальные клетки молочной железы. Оценивалось количество погибших клеток, а также находящихся в состоянии апоптоза и некроза. Для оценки жизнеспособности клеток bMECs мы использовали метод тройного окрашивания Hoechst 33342, пропидиум иодидом и флуорогенным субстратом каспазы 3/7 NucView 488. Показано, что rSEI вызывает некротические изменения в исследованных клетках. При этом, обработка rSEH приводила к появлению клеток в состоянии апоптоза. При действии rSEG не обнаружено достоверного увеличения в количестве клеток в состоянии некроза или апоптоза. Однако оценка общего количества погибших клеток показала что все три токсина оказывают цитотоксический эффект. Важно отметить, что при обработке клеток rSEG мы наблюдали большое количество клеточного дебриса, окрашенного Hoechst 33342. Этот факт свидетельствует о том, что к моменту регистрации сигнала после обработки rSEG, большая часть клеток могла уже погибнуть и фрагментироваться. Это предположение может объяснять столь малые изменения в количестве некротических и апоптотических клеток в случае инкубации с rSEG. Описанный дебрис наблюдался только в случае rSEG, что может свидетельствовать о его наибольшей токсичность. Таким образом, эти результаты показывают, что все три rSEs демонстрируют значительное цитотоксическое действие, приводя к индукции процессов апоптоза и некроза. Исследовано влияние энтеротоксинов стафилококков на развитие окислительного стресса в bMECs по общему уровню активных форм кислорода. Детекция проводилась с использованием флюоресцентного красителя DCFH2-DA. Результаты анализа позволяют предположить, что исследуемые токсины активно стимулируют генерацию активных радикалов, при этом rSEG проявляет наибольшую активность. Исследовано влияние энтеротоксинов стафилококка на уровень ионов кальция в цитозоле bMECs. Регистрировалась динамики изменения концентрации внутриклеточного кальция в клетках в присутствии rSEs с помощью флуоресцентного кальций-чувствительного зонда Fluo-3 AM. Наибольшая скорость роста внутриклеточной концентрации кальция показана для клеток, обработанных rSEG. В случае rSEI скорость роста незначительно возрастала относительно контроля. При обработке клеток rSEH не наблюдается эффекта. Для rSEG его действие на уровень кальция в bMECs было рассмотрено при различных концентраций токсина. Показано, что rSEG влияет на динамику изменения уровня кальция в клетке. При увеличении концентрации токсина выход сигнала на плато происходит быстрее, тогда как в случае контролей этого не наблюдается. Необратимое длительное повышение концентрации кальция является индуктором множества внутриклеточных сигнальных процессов, приводящих к гибели клеток. Для исследований, запланированных на следующие этапы проекта, был выделен набор моноклональных антител мыши, специфичных к энтеротоксинам стафилококков. Были проэкспрессированы и очищены рекомбинантные энтеротоксины, физико-химическими и иммунохимическими методами показана нативность вторичной структуры полученных токсинов. По итогам микробиологических исследований в общей сложности 546(48,23%) образцов молока и смывов были положительными на Staphylococcus spp. из которых 260 были положительными на St aureus, 14(1,24%) – на Escherichia coli, 594(52,47%) – на Pseudomonas aeruginosa. Бактерий рода Salmonella обнаружено не было. Все штаммы обладали различной антибиотикоустойчивостью По итогам анализа 16S рРНК в отобранных образцах преобладал S. Aureus.
Отчет за 2021 год.
Полногеномное секвенирование изолятов S. aureus, выделенных из молока коров позволило выявить ряд региональных особенностей. На основании биоинформатической обработки были распознаны потенциально токсикогенные по энтеротоксинам изоляты. При этом наблюдалась генетическая вариация по регионам Российской Федерации. Так, при анализе генов энтеротоксинов было установлено, что в образцах из Калининградского региона стафилококки содержали ген sea, а в образцах из Якутии, гены seg, sei. При этом во всех изолятах S. aureus были идентифицированы гены гемолизинов (hla, hlb, hlg, hld) и гены лейкоцидинов (lukE/D, lukM/F) Последняя группа генов по современным литературным данным связывается с маститом коров в других регионах мира. Генетический анализ позволил установить структуру энеротоксикогенного кластера egc, характерного для Якутского региона. Он состоял из генов selm, seln, selo, selu, seg и sei и имел одинаковую последовательность для всех Якутских изолятов. Было проведено исследование пангеномов полных собранных геномов S. aureus. Для сравнения нами использовались геномы доступных в NCBI стафилококков: S. aureus, ассоциированных с патологиями человека и S. aureus, ассоциированных с патологиями коров и 8 геномов S. aureus, полученных в данном исследовании. Геномный анализ с использованием мультилокусного типирования и определения клональных комлексов показал, что изоляты S. aureus с разных ферм Якутского регина имеют близкую филогению - 4 изолята принадлежат к типу ST1651, а один отличается и принадлежит ST97/CC97. Типирование по белку A так же показало сходство четырех изолятов (spa - t9303), пятый изолят обладает уникальным типом гена spa. Установлено, что при сужении выборки до определенного региона (Якутия) уникальными генами оказались гены, находящиеся в кластере, ассоциированном с островком патогенности SAPI. Для исследования роли барьерных структур – клеток эпителия молочной железы коров в защите от факторов патогенности стафилококков, анализировалось действие наиболее часто встречающихся у больных маститом животных энтеротоксинов: G и I, энтеротоксин H был взят в качестве контроля. Исследовалась роль обозначенных выше энтеротоксинов стафилококков в развитии окислительного стресса, изменениях уровня внутриклеточного кальция, а также продукции активных форм кислорода. Учитывая, что микроорганизм способен секретировать несколько энтеротоксинов важно установить взаимовлияние, кооперацию энтеротоксинов при действии на ткани и клетки, приводящие не только к гибели клеток, но и способность индуцировать синтез клетками эпителия сигнальных молекул - интерлейкинов. Исследован кооперативный эффект энтеротоксинов стафилококков и их влияние на продукцию противовоспалительных цитокинов в клетках эпителия молочной железы по изменению уровня соответствующей мРНК в ткани. Полученные результаты свидетельствуют о том, что рассмотренные энтеротоксины стимулируют генерацию активных радикалов, при этом SEG проявляет наибольшую активность. Было проанализировано кооперативное действие энтеротоксинов SEG, SEH и SEI. Показано, что содержание IL-8 при совместном действии токсинов не повышался по сравнению с его уровнем при действии индивидуальных токсинов. Таким обрразом, токсины стафилококка SEG, SEH и SEI не обладают кооперативным эффектом. В результате было выявлено, что энтеротоксины SEG, SEH, SEI стимулируют генерацию синтез мРНК IL-8, не изменяя при этом уровень TNFα, в клетках (bMEC), при этом SEG проявляет наибольшую активность. Показана дозозависимая реакция клеток. Одним из объяснений такого набора энтеротоксинов может быть наличие общих рецепторов, взаимодействие с которыми и ограничивает усиление сигнала. Это предположение требует дальнейших исследований.
