Отчет за 2019 год.
Проект направлен на решение проблемы длительной консервации (криоконсервация и лиофильная сушка) репродуктивных клеток с целью сохранения генетического разнообразия сельскохозяйственных птиц in vitro и дальнейшего их использования при создании новых селекционных форм с привлечением генофондных пород кур.
1. Подготовлены криоконсервированные образцы спермопродукции: смешанных и индивидуальных эякулятов (не менее 300 образцов) Выращено и пробонитировано по экстерьерным признакам экспериментальное поголовье кур (n=200 гол.) с возраста 1 суток до 115 дней, полученное от птицы БРК «Генетическая коллекция редких и исчезающих пород кур» ВНИИГРЖ. Проведена поэтапная оценка и отбор петухов по реакции на абдоминальный массаж с целью получения спермы в условиях индивидуально-клеточного содержания в возрасте 120-160 дней (n=70 гол.). Проведена индивидуальная оценка петухов по качеству нативного семени (n=50 гол.) в полевых условиях: объем (мл), концентрация (млрд/мл), активность (балл). Для дальнейших исследований по совершенствованию технологии замораживания и оттаивания семени сельскохозяйственных птиц, для изучения влияния породных и индивидуальных различий в криотолерантности семени петухов, для разработки технологии лиофилизации согласно планам проекта были подготовлены в течение 3 месяцев образцы семени петухов 10 генофондных пород - 1218 шт. (смешанных – 727 шт., индивидуальных - 491 шт.). Размах изменчивости активности сперматозоидов в нативном семени составил от 75% до 90%, изменчивость активности сперматозоидов в заморожено/оттаянном семени составила от 18% до 55%. Полученные данные также отражают межпородные и внутрипородные различия в криорезистентности репродуктивных клеток петухов.
2. Экспериментальные данные по оценке криотелерантности спермы петухов, полученной от 10 генофондных пород использованием метода Sperm Class Analyzer CASA system. Получены экспериментальные данные по оценке криотолерантности семени петухов по 10 генофондным породам (павловская золотистая, бентамка ситцевая, род-айланд, китайская шелковая, орловская ситцевая, фавероль, брама палевая, итальянская куропатчатая, кохинхин карликовый, чешская золотистая) с использование традиционных методов и с использованием CASA. В опыте использовались петухи (n=26) с высокой активностью сперматозоидов нативного семени от 75% до 95%. При оценке активности сперматозоидов обоими методами отмечено снижение активности в заморожено/оттаянном семени до 10-75% при визуальной оценке, и до 18-74% при использовании CASA. В 30% случаев визуальная оценка и оценка CASA не совпали. Получен ранговый коэффициент корреляции на уровне rs=0,56 (p <0,005) между показателями активности заморожено/оттаянной спермы, оцененной двумя методами, что указывает на существенные различия в результатах. Очевидно, что для получения достоверной информации по оценке криотолерантности семени целесообразно использование системы CASA, позволяющей оценить количество жизнеспособных и морфологически нормальных клеток, массовую подвижность и различные параметры движения, включая процент подвижных сперматозоидов. Использованная в исследовании программа CASA (ZooSperm-1.0) требовала большой ручной корректировки из-за несовершенства определения ею скорости движения сперматозоидов петухов, которая значительно превышает скорость движения сперматозоидов млекопитающих; существенных морфологических различий по форме и размеру спермиев по сравнению с млекопитающих. Требуется разработка компьютерной программы для работы с семенем птиц, учитывающей видоспецифичность. Тем не менее, очевидны значительные межпородные различия в криотолерантности семени, причины которых подлежат дальнейшему изучению.
3. Экспериментальные данные по апробации методики оценки функционального состояния сперматозоидов до и после криоконсервации с помощью метода связывания вителлинового слоя яйцеклетки in vitro. Апробирован метод Robertson (1997) определения фертильности сперматозоидов с использованием вителлиновой мембраны яйцеклеток виргинных кур. Произведена модификация апробированного метода с целью снижения временных и трудозатрат, а также снижения затрат на используемые реактивы. Впервые, в отличие от метода Robertson (1997): 1) мы не разделяли слои вителлиновой мембраны на внутренний и наружный, тем самым сократили временные затраты на подготовку образцов; 2) использовали для отмывания вителлиновой мембраны от остатков желтка охлажденную дистиллированную воду вместо среды Dulbecco; 3) взаимодействие сперматозоидов с внутренним слоем вителлиновой мембраны проводили на предметном стекле, а не в пробирке, при этом микроскопический анализ показал визуальное соответствие исходному методу. Метод оценки фертильности семени в нашей модификации позволяет оценить его функциональную полноценность и прогнозировать оплодотворяющую способность. Получены убедительные различия по количеству точек взаимодействия сперматозоидов и внутреннего слоя вителлиновой мембраны яйцеклетки кур при использовании нативного и заморожено/оттаянного семени, а также заморожено/оттаянного с визуально одинаковыми показателями активности сперматозоидов, но, вероятно, разной функциональной полноценностью (целостностью мембран сперматозоида, сохранностью акросомы). Всего для отработки метода было задействовано 20 образцов семени. Данный метод обладает неоспоримым преимуществом перед традиционным методом оценки функциональных качеств семени только по активности сперматозоидов. Становится очевидным, что показатель подвижности спермиев не является достаточным критерием для достоверного прогнозирования фертильности семени, поэтому необходима разработка методики комплексной оценки заморожено/оттаянного семени, объединяющей в себе целый ряд критериев. Модифицированный метод оценки функционального состояния сперматозоидов будет использован в дальнейшей работе над проектом.
4. Предложен состав экспериментальной среды для криоконсервации спермы петухов с использование дисахаридов естественного происхождения. Впервые получены экспериментальные данные по использованию новой среды с дисахаридом естественного происхождения трегалозой для криоконсервации семени петухов. В процессе проведения исследования яйца кур ежедневно собирали в течение 9 дней, для контроля динамики снижения оплодотворенности дополнительно собирали яйца через 5,10 и 15 дней после последнего осеменения, всего проинкубировано 400 шт. для оценки оплодотворенности. Оплодотворенность яиц оценивали при вскрытии яиц после 6 суток инкубации. Оценка эмбрионального развития показала, что все эмбрионы соответствовали стандартам развития по Hamburger & Hamilton (1951), стадии 29-30; случаев ранней эмбриональной смертности отмечено не было. Показатели оплодотворенности яиц определялись по дням сбора с учетом периодичности осеменений в зависимости от состава криозащитной среды для разбавления семени петухов. Разработанная нами среда (опытная-1, опытная-2) для криоконсервации семени петухов обеспечивает значительно более высокие показатели оплодотворенности яиц 82% и 86% соответственно, по сравнению с обычно нами используемой средой ЛКС-1 (79%, контроль, разработка 1984 года). Полученные результаты оплодотворенности яиц при использовании заморожено/оттаянного семени превосходят средний мировой уровень, который по литературным данным не превышает 30% (Fulton, 2006). Особенно следует отметить увеличение продолжительности фертильности сперматозоидов в половых путях кур при использовании опытных сред. Даже на 12-й день после последнего осеменения оплодотворяемость яиц оставалась на приемлемом уровне 50-55% против 20% в контроле. Динамику функционального состояния сперматозоидов при использовании новых сред определяли по методу Bakst (2014). Было установлено, что функциональная полноценность заморожено/оттаянных спермиев и их переживаемость в половых путях курицы существенно различались в зависимости от состава используемой среды для криоконсервации. Количество точек взаимодействия сперматозоидов с вителлиновой мембраной яйцеклетки на 1см2 в группе контроля и опытных группах 1 и 2 на 4-й день после последнего осеменения составило соответственно 57 шт./см2, 300 шт./см2 и 500 шт./см2. На 15-й после последнего осеменения в контрольной группе наблюдалось отсутствие точек взаимодействия, а в опытных группах 1 и 2 оно составило 91 шт./см2 и 345 шт./см2 соответственно.
Отчет за 2020 год.
1. Получены экспериментальные данные для создания протокола технологического процесса лиофилизации семени петухов с учетом этапов.
1.1. Пробоподготовка (протокол замораживания семени петухов для последующей лиофолизации).
- Экспонирование нативного семени в разведении 1:1 разработанным разбавителем ЛКС-Т10 (2019г.) в течение 40 мин.
- Состав среды: из расчета на 100 мл дистиллированной воды: глутамат натрия 1,92 г, ацетат калия 0,5 г, поливинилпирролидон 0,3 г, сульфат протамина 0,032 г, фруктоза 0,72 г, трегалоза 0,166 г.
- Центрифугирование 1 мл нативного семени при 3 тыс. об./мин в течение 10 мин.
- Удаление надосадочной жидкости, конечный объем центрифугата составляет от 200 мкл до 300 мкл.
- Внесение 5 мкл концентрированного раствора трегалозы (0,015 г на 0,025 г разбавителя ЛКС-1) в целях сохранения целостности мембран сперматозоидов в каждый центрифугат. Проведение вторичного экспонирование в течение 10 мин.
- Внесение криопротектора диметилацетамида в конечной концентрации 6% и эквилибрация образца в течение 1 мин.
- Распределение семени на поверхности стенок стеклянного флакона и проведение замораживания в тонком слое в парах жидкого азота по методу Курбатова А.Д. и др. (1984).
1.2. Первичная сушка семени петухов в лиофильной сушилке TFD-8501 (ilShinbiobase Co. Ltd, Южная Корея).
- создана принципиальная экспериментальная модель устройства для поддержания необходимого низкотемпературного режима на пробах (от -150 град. в начале процесса до -50 град. при окончании) в условиях вакуума в процессе первичной лиофильной сушки;
- подобран экспериментальный режим первичной сушки семени петухов на установке TFD-8501 (ilShinbiobase Co. Ltd, Южная Корея): предварительное охлаждение конденсора до температуры -70,0°С; достижение режима рабочего вакуума после охлаждения конденсора ~13-14 мин; продолжительность первичной сушки в режиме рабочего вакуума (5 mTorr) - 2 часа.
1.3. Регидратация лиофилизированного образца.
- Экспериментальный состав среды для регидратации (из расчета на 100 мл дистиллированной воды: глутамат натрия 1,92 г, ацетат калия 0,5 г, поливинилпирролидон 0,3 г, сульфат протамина 0,032 г, фруктоза 0,8 г, несульфированный гликозаминогликан - гиалуроновая кислота 0,04г), позволяющий снижать степень агглютинации сперматозоидов.
2. Определены критерии качества семени петухов, необходимые для эффективного использования в технологическом процессе лиофилизации:
- объем эякулята (при необходимости сохранения индивидуальных эякулятов) не менее 0,8 мл;
- общая подвижность заморожено/оттаянного в гранулах семени не менее 30%;
- поврежденность мембран заморожено/оттаянных в гранулах сперматозоидов не более 50,0%;
- степень поврежденности хроматина заморожено/оттаянных в гранулах сперматозоидов не более 40,0%.
3. Впервые в мире проведены эксперименты по лиофилизации семени петухов.
- впервые доказана возможность сохранения морфологической целостности, в том числе кинетического аппарата, сперматозоида позвоночных животных в процессе лиофилизации;
- впервые получены результаты, доказывающие возможность сохранения фертильности сперматозоидов в процессе лиофилизации семени (по результатам искусственного осеменения виргинных кур регидратированным семенем получены данные о числе точек взаимодействия сперматозоидов с вителлиновой мембраной желтка яиц - до 37 шт/см2, получено одно оплодотворенное яйцо из 9 снесенных яиц, собранных за 1 день).
Отчет за 2021 год.
1. РАЗРАБОТАН НОВЫЙ СОСТАВ СРЕДЫ ДЛЯ КРИОКОНСЕРВАЦИИ СЕМЕНИ ПЕТУХОВ, ОБЕСПЕЧИВАЮЩИЙ ВЫСОКИЙ УРОВЕНЬ ФЕРТИЛЬНОСТИ ЗАМОРОЖЕНО/ОТТАЯННОГО СПЕРМАТОЗОИДОВ ПЕТУХОВ. Верифицирован новый состав среды Treh20 для криоконсервации семени петухов в гранулах. Состав среды разработан на основе комбинации моносахарида (fructose) и невосстанавливающего дисахарида (trehalose). Впервые доказана проницаемость мембран сперматозоидов петухов для невосстанавливающего дисахарида трегалоза. В качестве контроля использовали среду ЛКС-контроль. Оценка проведена в условиях БРК «Генетическая коллекция редких и исчезающих пород кур» ВНИИГРЖ на птице породы род-айланд красный (♂ 20 гол., ♀ 100 гол.). Использование комбинации трегалозы и фруктозы позволило значительно повысить сохранность хроматина сперматозоидов - до 92,4% (Treh20) по сравнению с ЛКС-контроль - 79,5%, а также получить значимые показатели повышения уровня оплодотворенности яиц до 61,4% при использовании Treh20 по сравнению с ЛКС-контроль – 54,2%. Оценка переживаемости семени в половых путях курицы на 7 день от последнего осеменения доказала эффективность среды Treh20: процент оплодотворенности яиц составил 27,3% против 0% в контроле.
2. ВПЕРВЫЕ РАЗРАБОТАН ПРОТОКОЛ ЗАМОРАЖИВАНИЯ СЕМЕНИ ПЕТУХОВ В ТОНКОМ СЛОЕ ДЛЯ ПОСЛЕДУЮЩЕЙ ЛИОФИЛЬНОЙ СУШКИ. 1. В образцы семени, предварительно оцененного и отобранного по качественным показателям (концентрация не менее 3 млрд/мл, общая и прогрессивная подвижность не менее 70% и не менее 40% соответственно) добавить разбавитель для криоконсервации семени петухов Treh20 в соотношении 1:1. 2. Экспонирование образцов при 5°С в течение 40 мин. 3. Центрифугирование семени - 3 тыс. об./мин в течение 10 мин, объем семени в градуированной пробирке для центрифугирования - 1 мл 4. Удалить пипеткой надосадочную жидкость; объем центрифугата должен составлять не более 300 мкл. 5. В центрифугат добавить 5 мкл концентрированного раствора трегалозы – 1,75М (0,015г на 0,025г разбавителя ЛКС) и экспонировать 10 минут при температуре 5°С. 6. Добавить криопротектор ДМА (диметилацетамид) в концентрации 6% от конечного объема пробы и провести экспонирование в течение 1 мин при 5°С. 7. В охлажденные до 5°С пенициллиновые флаконы, размещенные в горизонтальном положении в термобоксе внести пипеткой 50 мкл семени 8. Семя быстро распределить по стенкам флакона равномерно тонким слоем. 9. Флакон с подготовленным образцом семени выдержать в парах жидкого азота при температуре -75°С в течение 3 минут (по методу Курбатова А.Д. и др., 1984). 10. Флаконы погрузить в жидкий азот. 11. Контроль качества заморожено/оттаянного семени провести после размораживания в водяной бане (t 60°C). Общая подвижность заморожено/оттаянного семени должна составлять не менее 30%.
3. ВПЕРВЫЕ РАЗРАБОТАНЫ ПРОТОКОЛЫ ПЕРВИЧНОЙ ЛИОФИЛЬНОЙ СУШКИ СЕМЕНИ ПЕТУХОВ И ЕГО РЕГАДРАТАЦИИ, ОБЕСПЕЧИВАЮЩИЕ СОХРАННОСТЬ МОРФОЛОГИИ СПЕРМАТОЗОИДОВ И ИХ ФЕРТИЛЬНОСТЬ (с использованием лиофильной сушилки TFD-8501, ilShinbiobase Co., Ltd, Корея) 1. Конденсор сублимационной сушилки заранее охладить до температуры -70°C и ниже. 2. Флаконы с семенем, замороженным в тонком слое, поместить в теплоизоляционный футляр с температурой -150°C. 3.Термоизолящионный футляр разместить в сушильной камере и включить программу запуска вакуумного насоса. 4. Рабочий вакуум 5 мТорр должен достигаться за 10–12 мин. 5. Лиофилизировать в течение 2-2,5 часов. 6. Флаконы укупорить. 7. Контроль влажности образцов проводить путем контрольного взвешивания после высушивания до постоянного веса при температуре 70°С или с использованием автоматического анализатора влажности, целевой показатель 6-7%. 8. Оценку качественных показателей семени проводить после его регидратации. Регидратацию провести с использованием экспериментальной среды ЛКС-GA5 при комнатной температуре мелкими каплями и довести объем лиофилизата до исходного объема семени.
4. СОСТАВ СРЕДЫ ДЛЯ РЕГИДРАТАЦИИ ЛИОФИЛИЗИРОВАННОГО СЕМЕНИ ПЕТУХОВ. Состав среды на основе несульфированного гликозаминогликана - гиалуроновой кислоты верифицирован в протоколе лиофилизации семени в сравнении с использованием дистиллированной воды, физраствора и ЛКС-контроль. Экспериментально установлено снижение степени агглютинации регидратированных сперматозоидов при использовании среды ЛКС-GA5 (табл.7). Число и размеры конгломератов сперматозоидов в оцениваемом микроскопически семени сократилось примерно в 2 раза.
5. РАЗРАБОТКА ОТЕЧЕСТВЕННОГО ПРОГРАММНОГО ПРОДУКТА ПО ОЦЕНКИ ПОДВИЖНОСТИ СЕМЕНИ ПЕТУХОВ (CASA). Впервые в России адаптируется отечественная разработка программы компьютерного анализа семени млекопитающих для семени сельскохозяйственных птиц (Computer System for semen analysis) CASA-ArgusSoft. Модуль по критерию "Подвижность Poultry" для оценки подвижности сперматозоидов петухов (общая подвижность, прогрессивная подвижность, проведена адаптация параметров движения), разработанный совместно компанией ООО «АргусСофт», внедрен. Приведена в соответствие с морфологическими особенностями сперматозоидов петухов (размер, форма головки, форма акросомы и др.) методика по критерию оценки семени - "Подвижность Poultry". Создана новая калибровка оценки подвижности сперматозоидов для используемой системы ввода (микроскопа и видеокамеры).
