В первый год реализации проекта создали опытные группы петухов и жеребцов. В опытную группу петухов вошли взрослые неродственные особи 14 пород не инбредных популяций, в группу жеребцов - лошади 15 пород. Отобранное поголовье петухов содержалось в индивидуальных клетках и регулярно проводился массаж брюшины петухов, стимулирующий получение спермы. Сперму жеребцов получали на искусственную вагину или вымывали из семенников после кастрации лошадей. Также были оценены образцы спермы из ЦКП «Коллекция генетических ресурсов» ФГНБУ ВНИИ коневодства. Дополнительно провели оценку спермы 130 быков. Сперму быков и жеребцов оценивали по подвижности, морфологии, целостности мембран, дыхательной активности, дефрагментации ДНК сперматозоидов. Сперму петухов - по подвижности, целостности мембран и дыхательной активности сперматозоидов. Анализ криорезистентности спермы петухов, жеребцов и быков, показал высокую вариабельность по всем исследуемым параметрам. Например, подвижность сперматозоидов петухов варьировала от 5 до 70%, прогрессивная подвижность сперматозоидов жеребцов от 0,5 до 70,8%. По морфологическим показателям также зафиксирована индивидуальная изменчивость. Количество клеток с поврежденными акросомами в сперме жеребцов наблюдалось от 4,6 до 38,8 %, а с повреждениями в области хвоста и шейки - от 1,8 до 62,1%, а у быков от 13,6 до 39,2 % и от 1,2 до 14,1 % соответственно; число повреждений мембран у сперматозоидов петухов зафиксировано от 29,1 до 73,8%. По дыхательной активности, оцененной по стимуляции дыхания 2,4-ДНФ, образцы различались следующим образом - в сперме петухов от 1,4 до 2,3, в сперме жеребцов от 1,0 до 2,2, а в сперме быков от 1,1 до 2,0. После формирования групп животных и птицы для гентипирования подготовили ДНК-образцы. Для выделения ДНК у птицы была взята кровь из вены крыла в микропробирку, содержащую в качестве антикоагулянта 30 мкл 0,5М ЭДТА. ДНК выделяли по стандартной методике с использованием фенольно-детергентного метода. ДНК жеребцов выделяли из спермы классическим методом, модифицированным в Лаборатории молекулярной генетики ВНИИГРЖ с использованием меркаптоэтанола и очистки фенолом. Определение качества ДНК проводилось с помощью прибора NanoDrop 2000 (Thermo Scientific). Образцы с соотношением поглощения А260/280 более 1,8 ед. и концентрацией более 50 нг/мкл отобрали для дальнейшего генотипирования. Таким образом в результате проведения исследований по проекту в 2018 году для генотипирования с помощью микрочипа Illumina Chicken 60K SNP iSelect BeadChip подготовлено 96 ДНК-образцов петухов, а для генотипирования с помощью микрочипа Affymetrix Equine HD array подготовлено 96 ДНК-образцов жеребцов. Генотипирование планируется провести в 2019 году.
Отчет за 2019 год.
Сохранение генетического материала ценных племенных животных предполагает использование криобанков семени и играет важную роль в программах сохранения генетических ресурсов. Повреждения, возникающие при воздействии низких температур, значительно снижают сохранность и эффективность использования генетического материала для разведения животных и птицы. Работа проводилась по нескольким направлениям. Первое направление предполагало анализ ДНК петухов с использованием для генотипирования чипа Illumina Chicken 60K SNP iSelect BeadChip и Affymetrix Axiom®600k Array. Объектом исследования была сперма петухов (Gallus gallus), разводимых в биоресурсной коллекции ВНИИРГЖ «Генетическая коллекция редких и исчезающих пород кур» (ВНИИГРЖ, Пушкин, Санкт-Петербург). Для анализа генотипов использовался подход GWAS (Genome-Wide Association Studies). Расчеты проводились с использованием программы PLINK, EMMAX, программного обеспечения R. Проводился анализ информации о локализации маркерных SNP с помощью геномных браузеров NCBI, Ensembl и других. Для анализа генотипов, полученных с помощью чипа Illumina Chicken 60K SNP iSelect BeadChip, были отобраны группы петухов, оцененные по качеству нативной спермы. Проведена оценка подвижности в этих образцах после криоконсервации. На полногеномном уровне выявлено несколько ассоциаций с криоустойчивостью семени, прошедших порог достоверности. Так SNP rs15557972 (P<1,36E-07) на хромосоме 10 в интроне гена LOXL1 возможно связан с формированием оболочки сперматозоида. Другой SNP rs15751385 (P<6,10E-06) находится на 6 хромосоме в интроне гена ENSGALG00000052127. При замене G на T (rs15751385) наблюдается значительное (с разницей 22%, p<0,01) снижение подвижности сперматозоидов после криоконсервации. При замене A на C (rs15557972) также наблюдали ухудшение подвижности (p<0,01) с 36% до 57%. Найденные молекулярно-генетические маркеры расположены в высокополиморфных районах генома, что предполагает необходимость их секвенирования и более глубокого изучения влияния отдельных SNP и гаплотипов на криорезистентность спермы. Для анализа генотипов, полученных с помощью Affymetrix Axiom®600k Array была сформирована группа петухов, где были собраны фенотипические показатели подвижности спермы до и после криоконсервации (без отбора по качеству нативной спермы, кроме образцов непригодных к замораживанию с нулевой подвижностью сперматозоидов). В результате GWAS анализа было выявлено 10 значимых SNP. На хромосомах GGA1, GGA 2, GGA3, GGA11, GGA19, GGA22, GGA24 были обнаружены SNP, связанные с сохранением подвижности сперматозоидов после замораживания. Обнаружены возможные гены-кандидаты: CACNA2D1, ZC3HC1, GPR37, ARL8B, FKBP14, MTCL1, BCKDHB, AMFR, GOSR1, ENSGALG00000051574, TRIM29. Почти все из найденных генов-кандидатов (по ортологии с генами человека) экспрессируются в мужских половых органах и, в основном, в семенниках. В некоторых случаях экспрессия в них является преобладающей. Участки, где обнаружены маркерные SNP необходимо секвенировать для более подробного изучения и поиска влияющих на признак полиморфизмов. Следующим направлением исследований по проекту является поиск геномных ассоциаций с показателем АППД (соотношение поступательно движущихся сперматозоидов к общему числу подвижных) у жеребцов. Генотипирование проводилось на чипах SNP Affymetrix Axiom®600k Array. Объектом исследования были 96 образцов замороженного семени жеребцов. Биологический материал (сперму) оценивали по качеству до и после замораживания каждого эякулята с помощью компьютерного анализа CASA (computer-assisted semen analysis) на микроскопе Axio Imager («Carl Zeiss Microscopy GmbH», Германия»). В результате исследования была найдена 101 значимая ассоциация. Обнаружены SNP в непосредственной близости от генов, ответственных за формирование оболочек клеток, а также кодирующих белки, влияющие на митохондриальную активность. Для поиска причинных мутаций проводится работа по поиску полиморфных вариантов в районах маркеров, обнаруженных с помощью GWAS. Она включает секвенирование участков ДНК кандидатных генов. Предполагается, что найденные полиморфизмы, либо сцепленные с ними геномные варианты связаны со структурами клеточных мембран, акросомами и митохондриями или снижают функциональность сперматозоидов, что приводит к нарушениям их поступательного движения после криоконсервации. Было определено, что найденные маркеры не являются породоспецифичными и могут использоваться отбора семени пригодного для криоконсервации у различных пород лошадей. Далее предполагается изучение распределения гомозиготных районов по хромосомам и оценка влияния на формирование признаков устойчивости спермы к криоконсервации. В настоящее время определено количество и распределение гомозиготных районов. Ведется поиск генов-кандидатов снижающих криорезистентность спермы у жеребцов. Проведенные исследования открывают возможности для изучения изменений, происходящих в клетках после заморозки. Найденные молекулярно-генетические маркеры будут использованы для отбора производителей, по признаку пригодности спермы к криоконсервации.
Отчет за 2020 год.
В текущем году работа проводилась по нескольким направлениям: поиск геномных ассоциаций с сохранением подвижности спермы после криоконсервации у петухов, жеребцов и полногеномный анализ ассоциаций с нарущениями в сперматозоидах быков после криоконсервирования и оттаивания. Проведен анализ генотипов, полученных с помощью чипов Affymetrix Axiom®600k Array для жеребцови петухов (два специализированных чипа) и BovineSNP50 для быков. Подобраны системы для генотипирования и секвенирования некоторых найденных маркеров. Для петухов в анализ были отобраны достоверно значимые локусы, расположенные в интронах генов BCKDHB и LRRTM4, а также в межгенном пространстве, расположенном вблизи генов ARL8B и TRIM29. В полученных после секвенирования локусах были выявлены однонуклеотидные замены (SNP), для быстрого и доступного генотипирования которых были подобраны соответствующие эндонуклеазы рестрикции. Проведено сравнение основных показателей спермы петухов по генотипам этих локусов. В результате поиска геномных вариантов, ассоциированных с показателями криорезистентности семени жеребцов найдены 1 потенциальный SNP, отвечающих за прогрессивную подвижность после оттаивания и 1 значимый и 1 потенциально-значимый SNP, отвечающих за разность прогрессивной подвижности до и после замораживания у жеребцов. Был проведен анализ полученных данных генотипирования жеребцов по выявленным в ходе исследований четырем однонуклеотидным заменам в экзоне гена GRM и ассоциации данных SNP с показателями качества спермы после криоконсервации, в качестве которых использовали оценку общей и прогрессивной подвижности сперматозоидов после оттаивания, а также процент падения уровня подвижности у оттаянной спермы по отношению к нативной. Так, по выявленной однонуклеотидной замене rs1147388106 наилучшими показателями по всем анализируемым параметрам обладала сперма жеребцов с гетерозиготным генотипом AG. Уровень общей и прогрессивной подвижности спермы жеребцов AG составил 60,46 и 40,07% против 33,73 и 21,56% соответственно у гомозиготных жеребцов GG, при этом достоверность разности по обоим показателям преодолела статистический порог и имела уровень p<0,05. По уровню падения подвижности после оттаивания сперма гетерозиготных жеребцов AG также имела лучший показатель 24,86%, что ниже, чем у жеребцов GG 29,30%. В ходе выполнения проекта был проведен ассоциативный полногеномный анализ качества и криоустойчивости спермы у быков. Было найдено более 130 генетических ассоциаций с морфологией сперматозоидов быков после замораживания. Были проанализированы такие показатели как нарушения в области хвоста и шейки, в головке и нарушения акросом. Выявленные ассоциативные связи показали важность генов связанных с энергетическим и обменом кальция в клетке, сигнальных путей, формирующих мембраны сперматозоидов и клеток предшественников, а также влияние изоформ белков, вызывающих нарушения при мейозе. Для анализа трех отобранных достоверно значимых участков гена POU6F2 крупного рогатого скота были подобраны праймеры. Сделан анализ генотипов по найденным полиморфизмам. Выяснено, что первым важным условием формирования сперматозоида является правильное функционирование генов, связанных с мейозом и созреванием сперматозоидов. Нарушения на этом этапе приводят к необратимым изменениям в клетке, вплоть до потери способности к оплодотворению. Работа генов отвечающих за формирование мембран и различных клеточных структур, связанных с функциями сперматозоидов, тоже важный фактор криорезистентности. Вторым важным условием функционирования сперматозоида является экспрессия генов, подготавливающих сперматозоид к оплодотворению. Это сигнальные пути энергетического обмена – для поступательного движения сперматозоида, и гены кальциевого обмена участвующие в подготовке к капацитации. Изменения в структуре белков могут приводить к преждевременной капацитации и нарушении целостности сперматозоида. Найденные молекулярно-генетические маркеры будут использованы для отбора производителей, сперма которых пригодна для замораживания в жидком азоте.
