2. Госзадание и проекты
  3. Проекты РФФИ
  4. Проект № 18-316-20009 (РФФИ) - Руководитель: Харзинова В. Р.

Проект № 18-316-20009 (РФФИ) - Руководитель: Харзинова В. Р.

Тема: Изучение ядерной и митохондриальной изменчивости географических группировок снежного барана, обитающих на территории Верхоянской горной страны, для сохранения биоразнообразия Ovis nivicola lydekkeri в условиях ведения охотничьего промысла.
Руководитель: Харзинова В. Р., к.б.н.
Участники: Доцев А.В., к.б.н., Бардуков Н.В., Соловьева А.Д., Мамаев Н.В. (ЯНЦ СО РАН)
Срок выполнения: начало 2019 год / окончание 2020 год

 

Аннотации

Промысловая охота является практически единственным источником удовлетворения потребностей коренных народов Севера в продуктах питания животного происхождения. Для жителей Якутии важнейшим промысловым видом является снежный баран (Ovis nivicola), охота на которого обеспечивает сохранение жизнедеятельности представителей этноса, народных традиций и культуры. Поддержание биоразнообразия для обеспечения способности таксонов адаптироваться к меняющимся условиям внешней среды, является основой поддержания традиционного образа жизни и здоровья коренных народов. Несмотря на относительно высокую численность якутской популяции снежного барана (около 60 тыс. особей), в ее пределах существуют группировки малой численности (например, группировка Хараулахского хребта – самой северной точки обитания снежного барана в Якутии – численностью около 500 особей), сохранение которых крайне важно для поддержания эволюционного потенциала популяции в целом.

Проект направлен на решение актуальной научной задачи – объективную оценку состояния генофондов промысловых видов животных на основе использования современных молекулярно-генетических методов с целью сохранения биоразнообразия и рационального использования генетических ресурсов животных.
В результате проведенных исследований с использованием современных молекулярно-генетических методов (полногеномное SNP-генотипирование с использованием ДНК-чипов высокой плотности – Ovine HD BeadChip, которые будут применены для исследования O. nivicola впервые, и исследование полиморфизма мтДНК) будет реконструирована демографическая история Верхоянской популяции снежного барана, в целом, и самой северной Хараулахской группировки, в частности. Будет усилена доказательная база существования северного рефугиума, в котором, предположительно, сохранилась предковая популяция снежного барана в период оледенения Верхоянской горной страны в позднем плейстоцене, давшая начало современной Хараулахской популяции. Будут разработаны научно-обоснованные предложения для придания последней особого охранного статуса, в том числе для внесения в новое издание Красной книги Республики Саха (Якутия), планируемого на 2018 год.
Результаты исследований найдут применение при разработке предложений по сохранению биоразнообразия снежного барана при ведении промысловой охоты. Поддержание биоразнообразия для обеспечения способности таксонов адаптироваться к меняющимся условиям внешней среды, является основой поддержания традиционного образа жизни и здоровья коренных народов. Будут получены новые данные для уточнения внутривидовой систематики снежных баранов, которая до настоящего времени остается неясной. Кроме того, они будут востребованы в сельском хозяйстве при создании систем производства будущего. Учитывая, что все дикие виды Ovis, включая снежного барана, способны давать плодовитое потомство при скрещивании с домашними овцами, популяция Ovis nivicola может рассматриваться в качестве неоценимого источника изменчивости при создании новых селекционных форм для северных регионов страны методами межвидовой гибридизации.

 

Участие в мероприятиях

 

  1. 26-29 сентября, VI международные научные чтения памяти Н. М. Пржевальского «Научные исследования – от истоков к вершинам», г. Смоленск. Устный доклад на тему: "Анализ полиморфизма митохондриального гена цитохрома в (cytB) в популяциях снежного барана (Ovis nivicola Eschscholtz, 1829), обитающих на территории Верхоянского хребта".
  2. 27 сентября, тематическая секция Российского фонда фундаментальных исследований, на базе ФНЦ животноводства - ВИЖ имени академика Л. К. Эрнста. Постерный доклад на тему: Изучение ядерной и митохондриальной изменчивости географических группировок снежного барана".
  3. 10-13 сентября, 7-я международная конференция по горным копытным (7th World Mountain Ungulate Conference) в г. Бозман, штат Монтана, США. Устный доклад на тему: "A new putative subspecies of snow sheep (Ovis nivicola Eschscholtz, 1829) from Kharaulakh ridge (northeastern Siberia)"
  4. 5-13 июля 2019 года, 37-ая конференция Международного Общества по Генетике животных (37-th International Society for Animal Genetics Conference) в г. Лерида, Испания. Постерный доклад на тему: "Complete mitochondrial genome sequencing reveals new extinct group of snow sheep (Ovis nivicola)".
Публикации

 

  1. Доцев А.В., Харзинова В.Р., Охлопков И.М., Медведев Д.Г., Протопопов А.В., Форнара М.С., Грицышин В.А., Гладырь Е.А., Медугорак И., Кунц Э., Багиров В.А., Брем Г., Зиновьева Н.А. Анализ полиморфизма митохондриального гена цитохрома b (cytb) в популяциях снежного барана (Ovis Nivicola Eschscholtz, 1829), обитающих на территории верхоянского хребта. 2019, 86-9
  2. Dotsev A.V, Kunz E., Protopopov A.V., Plotnikov V.V., Okhlopkov I.M., Shakhin A.V., Kharzinova V.R., Fornara M.S., Deniskova T.E., Krebs S., Peters J., Medvedev D.G., Sipko T.P., Bagirov V.A., Brem G., Medugorac I., Zinovieva N.A. Complete mitochondrial genome sequencing reveals new extinct group of snow sheep (Ovis Nivicola). 2019, 76
Отчёты
  1. За отчетный период выполнения работ по проекту, с целью сбора биологического материала и документации морфологических данных снежного барана, были организованы экспедиции на Центральное Верхоянье на верховье р. Барайы (в период с 01 августа 2019 г. по 23 августа 2019 г.) и Северное Верхоянье в Булунский район на Хараулахский хребет (в период с 30 июля 2019 г. по 13 августа 2019 г.). 
В результате проведённых работ, был произведён сбор биологического материала 8 образцов снежных баранов (6 образцов центрально-верхоянских и 2 образца хараулахских снежных баранов).
Кроме того, во время проведения экспедиций на Хараулархский хребет и Центральное Верхоянье были документированы морфологические данные отобранных образцов. Частично обработанные результаты по морфологии и по краниометрии снежных баранов за текущий год, выявили, что общая длина тела самцов центрально-верхоянских снежных баранов (n=6) варьирует в пределах от 142 до 157 см, составляя в среднем 149,5 см, длина тела самцов хараулахских снежных баранов (n=2) варьирует в пределах от 139 до 142 см, составляя в среднем 140,5 см. По общим размерам тела самцы центрально-верхоянских баранов ненамного крупнее хараулахских баранов и имеют близкие показатели с корякскими, но заметно мельче камчатских. Сравнительный анализ данных наших результатов с данными Чернявского (1964), Ревина и др. (1988) и Железнов-Чукотского (1994), показали, что самцы центрально-верхоянских толсторогов ненамного выше хараулахских толсторогов, но ниже в плечах, чем корякские и камчатские сородичи (доп. файл, табл. 1).
Краниометрическая характеристика выявила, что в отличие от камчатских баранов, якутские толстороги имеют достоверно меньшие костные стержни рогов, укороченную и более узкую морду, удлиненные носовые кости (Кривошапкин, Яковлев, 1999). По нашим предварительным данным, возможно есть различия между харулахскими и центрально-верхоянскими баранами, которые могут проявляться в размерах наибольшей ширине черепа и мастоидной ширине. Однако, достоверно об этом утверждать преждевременно, в связи с малым количеством черепов хараулахских баранов 10 и более лет (доп. файл, табл. 2).
За отчетный период выполнения исследований по проекту, в ходе выполнения экспедиционных работ в различные районы Якутии, было отобрано 152 образца волка, а также для изучения географической изменчивости линейных параметров волка исследованы туши волков.
Измерения линейных размеров частей тела центрально-якутских, центрально-верхоянских и арктических волков проводились у волков в возрасте от 2 лет и старше и представлены в таблице 3 (доп. файл). Проведенный анализ показал, что в каждой из групп довольно высокая вариабельность большинства показателей. Длина тела у арктических и центрально-верхоянских волков увеличивается по сравнению с центрально-якутскими. Такие показатели, как длина уха, длина ступни не различаются в изученных географических группах. Значение косой длины туловища и высоты в холке с передвижением на Север плавно увеличивается, при этом у арктических волков значение этого показателя намного выше, чем у центрально-якутских и центрально-верхоянских.
Арктические волки отличаются от центрально-якутских и центрально-верхоянских большими размерами, в том числе длиной тела, косой длиной туловища, длиной хвоста, и высотой в холке. Сравнивая полученные данные о размерах тела якутской популяции, можно отметить, что у данных волков длина ступни, высота уха, не отличаются, а хвост у самок короче.
Сравнительное исследование изменчивости параметров черепов полярных (арктических) и лесных волков (центрально-верхоянские, центрально-якутские) различных географических популяций, также проводились в пределах Якутии. Для изучения географической изменчивости параметров черепа исследовано 58 черепов взрослых полярных и лесных волков. Для сравнительного исследования в каждой популяции были сняты промеры черепов, добытых охотой взрослых волков. Установлено, что изменения размеров черепа волка носят адаптивный характер к условиям среды обитания. Известно, что параметры тела и краниологические показатели млекопитающих, согласно теории «клинальной географической изменчивости», имеют закономерную тенденцию снижения с севера на юг.
Результаты нашего морфологического обследования черепов лесных и полярных волков Якутии показали, что изменения параметров волка в целом хотя и соответствует общему правилу, однако имеет свои особенности (доп. файл, табл. 4). Установлено, что полярные (арктические) и лесные (центрально-верхоянские, центрально-якутские) волки Якутии по основным параметрам черепа слабо различимы. Достоверность различий по ним между волками различных географических регионов минимальная. Лишь по общей и кондилобазальной длине тундровые волки немного превосходят центрально-якутских и практически сходны с центрально-верхоянскими волками.
Кроме того, сравнительные исследования параметров черепа географических групп волков выявили, что центрально-верхоянские превосходят по всем параметрам черепа центрально-якутских.
За отчетный период выполнения работ по проекту, банк ДНК был пополнен 8 образцами снежного барана (6 образцов центрально-верхоянских и 2 образца хараулахских снежных баранов), а также 152 образцами полярных (арктические) и лесных (центрально-верхоянские, центрально-якутские) волков Якутии.
В связи с тем, что при проведении нами исследований гипервариабельного фрагмента митохондриального генома снежного барана (D-петли), к сожалению, были получены не интерпретируемые результаты, и принимая во внимание тот факт, что данный участок позволяет отследить лишь недавние эволюционные события в популяциях, нами было выполнено секвенирование гена цитохрома b (Cyt-b) не только якутского, но и других подвидов снежного барана. Кроме того, было выполнено сопоставление полученных результатов анализа гена цитохрома b снежного барана с данными митохондриального генома других представителей рода Ovis.
В общей сложности были получены секвенированные последовательности 87 образцов якутских, 9 образцов камчатских, 8 образцов корякских и 3 образца путоранских снежных баранов.
В качестве материала для исследования была использована мышечная ткань снежных баранов, представляющих различные подвиды: камчатский (KAM, n = 9), корякский (KOR, n = 8), путоранский (PUT, n = 3) и якутский (n = 87). Последний подвид был разделен на следующие группировки: Хараулахский хребет (Тикси) (TIK, n = 21), хребет Орулган (ORU, n = 25), центральное Верхоянье (VER, n = 23), хребты Сунтар-Хаята (SKH, n = 11), Момский (MOM, n = 7). В качестве групп сравнения были добавлены последовательности гена cytb мтДНК, североамериканских баранов, депонированных в базе данных GenBank NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov): барана Далла (O. dalli) (ODA, n = 3), толсторога скалистых гор (O. canadensis canadensis) (OCC, n = 8) и пустынного толсторога (O. canadensis nelsoni) (OCN, n = 11). Полный список использованных образцов из базы данных GenBank NCBI представлен в таблице 5 (доп. файл).
Выравнивание последовательностей мтДНК проводили с использованием алгоритма MUSCLE (Edgar, 2004) в программе MEGA 7.0.26 (Kumar и др., 2016). Для построения медианной сети гаплотипов (Bandelt, 1999) была использована программа PopART 1.7 (Leigh, Bryant, 2015). Для филогенетической реконструкции байесовским методом были отобраны по одному образцу, с наиболее часто встречающимся гаплотипом, из каждой популяции. Исключение составила группировка с хребта Орулган, представленная двумя образцами, относящимися к центральному Верхоянью – VER/ORU и к Хараулахскому хребту – TIK/ORU. Построение байесовского филогенетического дерева проводили с помощью программы MrBayes 3.2.6 (Ronquist, 2012) и последующей визуализацией в FigTree 1.4.2 (http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree). Определение лучших моделей эволюционных замен проводили отдельно для каждого нуклеотида в программе PartitionFinder 2 (Lanfear, 2017) с использованием информационного корректированного критерия Акаике (AICc) (Akaike, 1974). Наиболее оптимальными оказались эволюционные модели HKY+I, HKY и HKY+G, соответственно для первого, второго и третьего кодонов гена cytb. Расчеты показателей генетического разнообразия были проведены в программе Arlequin 3.5.2.2 (Excoffier, Lischer, 2010). Попарные генетические дистанции рассчитывались методом Tajima-Nei (Tajima, Nei, 1984), в программе MEGA 7.0.26. Далее на основе этих дистанций было построено филогенетичекое дерево по методу “сеть соседей” (Neighbor-Net) в программе SplitsTree 4.14.6.
В общей сложности у 107 образцов снежного барана было идентифицировано 19 гаплотипов. При этом у O. n. koriakorum и O. n. borealis, а также у популяции O. n. lydekkeri с Момского хребта было выявлено всего по одному гаплотипу. Из анализа полученной медианной сети (доп. файл, рис. 1.), следует, что наиболее обособленной и близкой к историческому предку современного снежного барана является группировка, населяющая горы Камчатки – O. n. nivicola, в которой было идентифицировано 5 гаплотипов. Все остальные образцы являлись производным одного гаплотипа, встречающегося в центральном Верхоянье – VER и на хребте Орулган – ORU. У образцов с Хараулахского хребта наблюдалось два гаплотипа, отличающихся между собой одной мутацией, один из которых также встречался у животных с хребта Орулган. Таким образом, наличие в ORU гаплотипов, отличающихся между собой четырьмя нуклеотидными заменами, подтверждает смешанное происхождение этой популяции, выявленное по результатам анализа SNP маркеров (Dotsev A.V., 2018). Был выявлен гипотетический гаплотип, связывающий популяцию с Хараулахского хребта с путоранским снежным бараном.
Аналогичная картина видна и при анализе байесовского филогенетического дерева (доп. файл, рис. 2.). Было показано, что два гаплотипа встречающиеся на Хараулахском хребте с высокой апостериорной вероятностью образуют один кластер. Их объединение в кластер с путоранским снежным бараном характеризовалось низкой апостериорной вероятностью – 0.67.
Эволюционные дистанции Tajima-Nei (доп. файл, рис. 3.), подтвердили, что камчатский снежный баран генетически наиболее удален от других исследованных группировок. Популяции якутского снежного барана с Центрального Верхоянья, хребтов Сунтар-Хаята и Момского имели схожие показатели генетических дистанций с популяциями с Хараулахского хребта и плато Путорана, соответственно – 0.005, 0.008, 0.005 и 0.005, 0.007, 0.006, и более низкие с корякской – 0.003, 0.005, 0.004. Учитывая дивергенцию хараулахской популяции снежного барана от других на уровне не ниже путоранского и корякского подвидов, по нашему мнению, эту популяцию следует рассматривать как отдельный подвид.
Показатели генетического разнообразия (доп. файл, табл. 6) в популяциях якутского снежного барана согласовались с данными полученными в исследовании, основанном на SNP маркерах. Так значения гаплотипического разнообразия (Hd) на Верхоянском хребте возрастали с севера на юг, от 0.381±0.101 у TIK до 0.746±0.098 у SKH. Наименьшие значения нуклеотидного разнообразия (π) и среднего числа нуклеотидных различий (K) также наблюдались у популяции снежного барана с Хараулахского хребта.
Тесты Таджимы и Фу, проведенные для выявления роли давления отбора на генетическое разнообразие, оказались статистически незначимыми во всех популяциях. Это свидетельствует о том, что все популяции не были подвержены влиянию естественного отбора и находятся в состоянии нейтрального равновесия.
В период выполнения работ по проекту, на основе анализа гена цитохрома b (Cyt-b), нами были проведены исследования времени расхождения (молекулярные часы) различных подвидов снежного барана.
В результате чего, с помощью программы BEAST, проведенный анализ времени дивергенции отдельных группировок снежного барана (доп. файл, рис. 4.) показал, что хараулахская популяция отделилась от якутского барана около 350 тысяч лет назад, и 250 тысяч лет назад от путоранского барана.
За отчетный период выполнения работ по проекту, с использованием чипа высокой плотности Illumina Ovine HD Beadchip, включающий в себя более 600 000 геномных вариантов и разработанного для домашних овец, нами впервые было проведено полногеномное исследование 24 индививдуумов снежного барана, образцы ткани которых, были отобраны в ходе экспедиционных исследований в географические точки Республики Саха (Якутия).
Геномную ДНК выделяли с помощью колонок Nexttec (“Nexttec Biotechnologie GmbH”, Германия) в соответствии с рекомендациями производителя. Скрининг SNP проводили с использованием биочипа Illumina Ovine HD Beadchip (Illumina Inc.”, CША), включающий в себя более 600 000 SNPs. Контроль качества SNP и статистический анализ полученных данных проводили с помощью программного обеспечения Plink 1.9. Контроль качества SNP включал в себя следующие критерии: исключение SNP, локализованных на половых хромосомах; исключение животных, в генотипе которых отсутствуют более чем 10% SNP от общего количества; исключение SNP при отсутствии в выборке локусов от общего уровня прогенотипированных более чем 10% (≥90%); исключение маркёров, не соответствующих критерию χ2 на равновесие в популяции по Харди–Вайнбергу (p ≤ 1 ⋅ 10–6); оценка качества генотипирования SNP по критериям GC Score (качество чтения SNP) не менее 0.5 (50%), по GT Score (уровень кластеризации SNP) не менее 0.3 (30%).
После проведения контроля качества осталось 13534 SNP. Данные SNP были локализованы на всех 26 аутосомах Ovis aries (доп файл, рис. 5). Наименьшее количество SNP наблюдалось на 26-й хромосоме – 252, а наибольшее на 1-й – 1498. В среднем на хромосому приходилось 520.5±61.2 полиморфных локусов. Также, был выполнен анализ распределения SNP в зависимости от частоты минорных аллелей (MAF), количество которых было распределено следующим образом: 0.1 – 5594, 0.2 – 2697, 0.3 – 1879, 0.4 – 1785, 0.5 – 1579 (доп. файл, рис. 6.).
Полученные результаты свидетельствуют не только о возможности использования данного чипа, но и более высокой информативности в сравнении с чипом средней плотности Ovine 50K SNP BeadChip (Illumina”, США): 13534 SNP против 1006 SNP.

 

Расширения для Joomla
Если заметили ошибку, выделите фрагмент текста (побольше) и нажмите Ctrl+Enter