Аннотация Проект № 20-16-00106 (РНФ)

Важнейшая задача современной агробиотехнологии - получение высококачественных и здоровых продуктов питания с высокой рентабельностью. Это невозможно выполнить, используя в производстве продуктов больных животных. Даже при благоприятных генетических параметрах животных, наличия технологических систем защиты, понижающих уровень патогенов в окружающей среде, они болеют (Cooke et al., 2019). Из всего разнообразия заболеваний животных можно выделить два, имеющие важнейшее значение для животноводства – мастит (Detilleux et al., 2018) и связанные с инфекционными заболеваниями потери плода у животных (Dahl et al., 2017). Целью проекта является выяснение закономерностей, связывающих эти два заболевания, а также установление внешних факторов и генетических особенностей систем защиты. В том числе устойчивость клеточных барьеров и основных факторов иммунитета, влияющих на заболевания и приводящих к проблемам оплодотворения и потере плода. Предполагается подобрать для исследования следующие группы животных: 1. клинически здоровые, с низким уровнем соматических клеток в молоке и нормально протекающей стельностью; 2. больные маститом; 3. имеющие нарушение репродуктивной функции (в т.ч. аборты); 4. больные маститом и имеющие нарушения репродуктивной функции. В настоящее время рядом лабораторий, включая и авторов проекта, получены данные о микробиоме молока коров. Полученные результаты имеют некоторые географические - региональные различия по составу микроорганизмов и подтверждают основные положения по патогенной микрофлоре, полученные методами клеточной микробиологии, биохимии и молекулярной биологии. Не изучены детали вопроса, не известны генетические особенности микроорганизмов, а также значимость различий в факторах патогенности. В предложенном проекте это предполагается исследовать методами метагеномики. Будут определяться геномы микробных сообществ, присутствующие у обозначенных выше групп животных, в молоке, репродуктивных органах и устанавливаться генетические особенности комменсальных и патогенных микроорганизмов. Исходя из этих знаний планируется провести более направленный поиск и выделение штаммов патогенных микроорганизмов в исследуемых группах животных. Будут изучены молекулярные механизмы антибиотикорезистентности, продукции систем защиты – систем чувства кворума, а также продукции бактериальных токсинов и факторов патогенности, используя набор методов клеточной и молекулярной биологии, генетической инженерии, а также иммунохимические методы. Планируется исследовать влияние факторов патогенности микроорганизмов на барьерные системы защиты – клетки эпителия молочной железы и эпителия – эндотелия репродуктивной системы. Показано, что бактериальные токсины способны вызывать не только гибель клеток этих систем, но и проникать в глубинные слои клеток, вызывая воспаление. Такие действия бактериальных токсинов могут быть как прямой причиной гибели оплодотворенной яйцеклетки на самых ранних этапах, так и вызывать гибель эмбриона на более поздних этапах, а также под действием различных факторов защиты иммунной системы, включая лимфокины и клеточные факторы защиты. На этот процесс может оказать значительное влияние патологии молочной железы, вызываемые в частности и факторами патогенности бактерий. Предлагаемые клеточные модели это несколько упрощенная система оценки, по сравнению с животным. Полагаем, что она позволит проводить большие серии определений и установить основные молекулярные и клеточные механизмы развития патологий маститов и репродуктивной системы, вызываемых микроорганизмами. Важно отметить, что защитные барьеры – клетки эпителия и эндотелия, имеют различающуюся степень устойчивости к бактериальным токсинам, кроме того не известно существование кооперативности действия токсинов на отдельные популяции клеток, эти вопросы предполагается выяснить при выполнении проекта. Энтеротоксины стафилококков способны проникать в глубинные слои тканей взаимодействую там с клетками иммунной системы и вызывать продукцию воспалительных цитокинов (SEC Суперантигены). Предполагается разработать новые методы оценки способности энтеротоксинов проникать в ткани. Для этого вместо используемых в настоящее время флуоресцентных красителей будут использованы квантовые точки с иммобилизованными суперантигенами. Это новый подход и он позволит авторам детально выяснить механизмы проникновения энтеротоксинов стафилококков в ткани и проследить развитие иммунологических реакций на такое проникновение. Все макроорганизмы находятся под защитой иммунной системы, которая сама принимает решение о защите и формах этой защиты. В предыдущем проекте РНФ авторы показали, что у коров больных маститом в молозиве и сыворотке присутствуют антитела к энтеротоксинам стафилококков, не было обнаружено прямой корреляции между носительством энтеротоксинов у выделенных штаммов и антителами к данному типу энтеротоксинов. Полагаем, что детальное метагеномное исследование позволит получить более конкретные ответы на данные вопросы. При этом, антитела являются показателем уже развившегося иммунного ответа, на начальных же этапах важную роль в распознавания патогенна и бактериальных токсинов играют Toll-рецепторы. В рамках проекта предполагается определить структуры и представленность этой группы молекул естественного иммунитета и определить наличие связи с изучаемыми заболеваниями. Много исследований посвящено роли антигенов главного комплекса гистосовместимости первого и второго класса в восприимчивости к инфекционным заболеваниям. Один из важных аспектов распознавания суперантигенов, к которым относятся и энтеротоксины стафилококков – стрептококков, это способность взаимодействовать с участками молекулы MHC-II и TCR, лежащими вне антиген-связывающих участков и как правило остающихся вне рамок таких исследований. Суперантигены взаимодействуют с различными вариантами структур и сопоставление спектра суперантигенов – энтеротоксинов с вариантами структур может пролить свет на особенности развития заболеваний и возможное перерастание их в хронические. Таким образом, в предложенном исследовании будут определены характерные для животных с маститом – потерей беременности микроорганизмы, определена генетическая особенность микроорганизмов устойчивости к антибиотикам, установлены факторы патогенности исследуемых микроорганизмов и проведено изучение их влияния на клетки, образующие барьеры – эпителиальные клетки молочной железы, клетки эпителия и эндотелия репродуктивной системы. Будут определены особенности участия иммунной системы животных в защите – реакции на патогены.