Отчет за 2019 год.
1. Был проведён анализ научной литературы с целью подбора методик и подходов для выполнения поставленной задачи: выявления участков генома - ответственных за отобранные признаки. Было проанализировано более 15 источников литературы, включая научные статьи, материалы конференций, тезисы, нормативная документация и т.п.
2. Для отбора образцов было выбрано два племенных хозяйства: СГЦ "Знаменский" (http://www.nsgc.ru) и "Воронежский" СГЦ (https://v-hava.ru).
2. Была создана база признаков-аномалий развития потомства, включающих суммарно 29 критериев исследованных хряков: Грыжа мошонки, Грыжа общая, Крипторхизм, Уродство при рождении, Маленький вес, Слабый поросенок, Недостаток кожи, Гермафродитизм, Дрожащий поросёнок, Серые пятна на шкуре, Чёрные пятна на шкуре, Проблемы с ногами, Атрезия анального отверстия, Несоответствие породе, Проблемы с ушами, Замечания по копытам, Замечания по соскам, Низкое качество семени, Проблемы с ЖКТ, Низкий материнский индекс, Выбраковка по возрасту, Низкое либидо, Родилось поросят всего, Живорождённых всего, Мумифицированные поросята, Общий вес гнезда при рождении, Единичный вес при рождении, Количество отнятых поросят, Вес при отъёме всего. Для "Воронежского" СГЦ были дополнительно отобраны 13 признаков: Мертворождённые поросята, Мумифицированные поросята, Маленький поросёнок, Аномалии опорно-двигательного аппарата, Уродства, Гермафродитизм, Вульвиты, Нежизнеспособность (Слабый поросёнок), Возраст достижения 100кг, Площадь мышечного глазка, 1,2,3 - точки с толщиной шпика.
3. Были отобраны в общей сложности более 150 образцов ткани из ушных выщипов. Были сформированы группы животных по 48 голов с учётом признаков аномалий их потомства.
4. Были получены геномные профили 96 образцов коммерческих пород свиней СГЦ "Знаменское" и "Воронежское". Была произведена оценка их генетической консолидированности и чистопородности для последующих ассоциативных исследований с помощью ДНК-чипов. На данный момент база находится в процессе расширения. Входные данные были обработаны по параметрами качества генотипирования 90% (--geno 0.1), частотой минорных аллелей не более 0,5% (--maf 0.05), ошибок по Менделю не более 1% (--mind 0.1) и неравновесного сцепления генов с шагом 50 kb (--indep-pairwise 50 5 0.5). Для генотипирования были использованы 2 типа чипов - Illumina Porcine SNP60 BeadChip V2, Illumina Inc. (San Diego, CA) включающий в себя 61565 SNPs (Single Nucleotide Polymorphism) и GGP Porcine HD BeadChip (Neogene Inc.) включающая более 70 тыс. SNP. Генотипирование было проведено на приборе Illumina iScan в соответствии с протоколом создателя. Данные генотипов были интерпретированы в BEADSTUDIO v3.2 (Illumina, San Diego, CA, USA). Импорт данных был произведён из FinalReport файлов, конвертированных в .ped формат с помощью плагинов, идущих в комплекте с Illumina iScan, а также языка R.
5. Были произведены полногеномные ассоциативные исследования (Genome-Wide Association Studies) в программном пакете GEMMA по линейной модели смешанного типа с учётом типа признака - опыт/контроль, а также по количественным признакам, на основе EBV-индексов, рассчитанных с помощью BLUPF90. Получены скорректированные P и Q-значения для отобранных показателей (Рис.1 А-Г).
6. Всего было идентифицировано 27 SNP, ассоциированных с качественными признаками заболеваний свиней, а также морфологическими отклонениями: патологии конечностей и копыт (14 SNPs), атрезия анального отверстия (5 SNPs), мумифицированные поросята (3 SNPs), спастический тремор поросят (5 SNPs) (Табл. 1).
7. В ходе исследований первого года, выпущена одна публикация в "Вавиловском журнале генетики и селекции" (Vavilov journal of genetic and breeding) . На данный момент находится в процессе рецензирования (Рис. 4), включён в WOS и Scopus.
Отчет за 2020 год.
1. Биобанк ДНК ВИЖ им.Л.К.Эрнста, используемый в данном исследовании, был расширен до 240 образцов тканей (ушных выщипов) свиней коммерческих пород (крупная белая и ландрас) из СГЦ "Знаменский" (http://www.nsgc.ru) и "Воронежский" СГЦ (https://v-hava.ru). Всего было отобрано 7 признаков, задокументированных у всех животных, входящих в выборку: мертворождение поросят, муммифицированные плоды, слабый (недоношенный) поросёнок, проблемы с ногами, вульвиты, врождённые уродства, гермофродитизм.
2. Всего было отобрано и протипировано 240 геномных профилей, включающих герминальные мутации у свиней коммерческих пород Крупная Белая и Ландрас. Входные данные были обработаны по параметрами качества генотипирования 90% (--geno 0.1), частотой минорных аллелей не более 0,5% (--maf 0.05), ошибок по Менделю не более 1% (--mind 0.1) без удаления неравновесного сцепления генов с шагом 50 kb (--indep-pairwise 50 5 0.5). Итоговый датасет включал 49439 SNP. Все маркеры, прошедшие контроль качества, были использованы для дальнейшего анализа. Для генотипирования были использованы GGP Porcine HD BeadChip (Neogene Inc.) включающая около 70 тыс. SNP. Генотипирование было проведено на приборе Illumina iScan в соответствии с протоколом создателя. Данные генотипов были интерпретированы в BEADSTUDIO v3.2 (Illumina, San Diego, CA, USA). Импорт данных был произведён из FinalReport файлов, конвертированных в .ped формат с помощью самописных скриптов на языке R. С помощью линейных моделей GWAS были выявлены полиморфизмы, ассоциированные с недоношенностью поросят - ALGA0116942 (ген PLPP1 и SLC38A9), ASGA0073065 (IL31RA), а также ASGA0059896 (ген SMIM11), ассоциированный с врождёнными уродствами. Также, с помощью методик кросс-машинного обучения были выявлены признаки, ассоциированные с врождёнными уродствами WU_10.2_3_2142870 (ген IQCE), WU_10.2_5_103536462 (ген TMTC2), MARC0073299 (ген STON2) и проблем с конечностями - WU_10.2_10_57301852 (U6), WU_10.2_14_9526791 (входит в гены ADAMDEC1 и ADAM7), DRGA0009021 (ген CFAP299), WU_10.2_X_127725116 (ген ARHGEF6), WU_10.2_X_124590037 (ген MBNL3).
3. Разработаны и апробированы 3 тест-системы на основе отобранных SNP маркеров (для генов SLC38A9, IL31RA, SMIM11) прошедших GWAS-валидацию, основанную на классических линейных моделях (каждая система включала симплекс с одним ДНК-полиморфизмом на 1 ген). rs81479220 ([замена AG, af=0.270] - ген PLPP1 (фосфолипидфосфотаза 1). Аннотирован у свиней, потомство которых при рождении имело вес меньше 1 кг. Одним из патологических биологических функций является поглощение липидов из внеклеточного пространства и может способствовать развитию аденокарциномы (рака) толстой кишки. Также данный SNP входит в ген SLC38A9 (Транспортер нейтральных аминокислот, связанный с натрием 9). Как и ген PLPP1 диагностирован у потомства свиней, вес которых при рождении был меньше 1 кг. Вероятно, участвует в восприятии аминокислот и активации сигнального комплекса, способствующего росту клеток в ответ на факторы роста, уровни энергии и аминокислоты. После активации связыванием аргинина обеспечивает высокую эффективность транспорта лейцина, тирозина и фенилаланина и требуется для эффективного использования этих аминокислот после расщепления лизосомного белка. rs81458548 (ген IL31RA [замена AG, af=0.269], интерлейкин 31 рецептор А). Также, как и гены PLPP1 и SLC38A9 диагностирован у потомства свиней, вес которых при рождении был меньше 1 кг. Участвует в развитие аллергических кожных заболеваний, связанных с дисфункции кожного барьера и регулировании других аллергических заболеваний. rs80803769 (ген SMIM11 [замена CT, af=0.175], маленький интегральный белок 11А). Аннотирован у свиней, потомство которых рождалось с диагнозом «урод». Исследований по биологическим и патологическим функциям не было проведено. На основании аналогов гена – SMIM1 и SMIM20, возможно предположить, что он отвечает за изменение состава крови и дыхательной системы у животных.
4. По результатам ДНК-типирования, и последующего исследования на основе количественного ПЦР в реальном времени были получены результаты анализа 288 голов свиней из СГЦ "Знаменское", не участвовавшие в генотипировании и ассоциативном анализе. В результате генетического анализа (n=288) на носительство генотипов были выявлено: для PLPP1 и SLC38A9 - 21(АА), 78(AG), 189(GG). Для IL31RA - 197(АА), 77(AG), 14(GG). Для SMIM11 - 221(CC), 49(CT), 18(TT).
5. В ходе анализа валидированных полиморфизмов мы смогли сформулировать методические рекомендации относительно применения разработанных тест-систем. На данный момент развитие молекулярной генетики, в том числе, внедрение метода полногеномного ассоциативного исследование в последние десятилетие, привело к изменениям методов прогноза и лечения заболеваний у животных. Появились качественно новые методы диагностики генетических заболеваний, приводящих к появлению потомства с аномальными признаками, распространению инфекционных агентов, а также профилактики и лечения различных заболеваний. Разработка и улучшение направлений методик стало благодаря увеличению точности проводимых исследований. Переход отрасли свиноводства к инновационному способу диагностики генетических аномалий позволяет выйти на экономическую стабильность, благодаря ранней выбраковки животных, несущих летальные и полулетальные гены. Данное исследование по выявлению аномальных признаков у популярных пород, используемых в свиноводстве, как для чистопородного, так и для разведения товарных помесей: крупная белая, ландрас и дюрок позволит селекционно-гибридным центрам и промышленным хозяйствам решить экономические задачи, связанных с затратами на выращивания и разведения животных и позволит на ранних стадиях отбирать ценных животных на воспроизводство и выбраковывать свиней, чье потомство будет нежизнеспособным. Таким образом, разработанные тест-системы по выявленным генам позволят диагностировать аномалии, такие как потомство меньше 1 кг (нежизнеспособное) и уродов, у свиноматок и хряков, отбираемых на производство.
6. Работа по тематике машинного обучения в полногеномных ассоциативных исследованиях в животноводстве - "Using the multiple machine learning-methods for detection of genomic regions associatied malformations in newborn piglets" отправлена в журнал GENES (https://www.mdpi.com/journal/genes) и находится в очереди на рецензию.
