Отчет за 2019 год. В соответствии с целью и задачами на 2019 год, сформулированными в проекте, исследования были направлены на выявление особенностей функционирования интрацеллюлярных компартментов в растущих (ВСВ+) и завершивших фазу роста (ВСВ+) ооцитах Bos Taurus и Sus Scrofa Domesticus с целью создания системы культивирования, обеспечивающей «экстрафолликулярное доращивание» женских гамет и получение яйцеклеток с высоким уровнем фертильности и разработки неинвазивных тестов оценки качества ооцитов. Идентифицированы особенности функционирования митохондрий в ВСВ+ и ВСВ- ооцитах в динамике культивирования. Проведен мониторинг показателей интенсивности флуоресценции зонда Mito Traker Orange CMTMROS (ИФ MTOCMTMROS, µA) в ооцитах коров на различных стадиях мейоза при пролонгации культивирования до 35 часов. На всех этапах культивирования ооциты, завершивших фазу роста in vivo, отличались более низкими показателями ИФ MTOCMTMROS, чем ооциты, оцененные до начала культивирования, как растущие. Оценена динамика функциональной активности актинового цитоскелета (интенсивность флуоресценции родамин фаллоидина -ИФРФ) в ВСВ-тестированных ооцитах коров при пролонгировании культивирования. Максимальная ИФРФ в ВСВ+ отмечена через 15 часов культивирования, а в ВСВ- - через 24 часа (51±4,9 усл.ед. против 32±5,6 усл.ед, P<0,05, t-критерий Стьюдента).). Проанализированы кинетика мейотических преобразований хроматина и функционирование липидома ВСВ+ и ВСВ−ооцитов свиней при пролонгированном культивировании. Выявлено, что пролонгированное культивирование (до 50 ч) провоцирует деструкцию хроматина как у ВСВ+, так и ВСВ− ооцитов (76% против 50%, Р<0,01, χ2-test). Процессы старения ооцитов свиней в результате пролонгирования культивирования сопровождаются изменениями морфологии липидных капель: гранулы трансформируется в кластеры. Высокий процент ВСВ− ооцитов с нормальным хроматином на стадии метафазы II может свидетельствовать о потенциальной возможности ооцитов, не завершивших фазу роста in vivo, закончить ее in vitro с последующим мейотическим дозреванием. Установлены достоверные различия в содержании лептина в жидкости фолликулов свиней, содержащих ВСВ+ ооциты и ВСВ- (0,23±0,03 нг/мл против 0,07±0,01 нг/мл, P <0,001, t-критерий Стьюдента). Продолжены эксперименты по моделированию систем дозревания ооцитов. Оценена компетентность к завершению мейотического созревания и показатели оплодотворяемости ооцитов Bos Taurus, выделенных из фолликулов разного диаметра (<3 мм, 3-5 мм, >5-8 мм) при воздействии 10 нг/мл рекомбинантного бычьего соматотропина (rBST.). Введение в систему дозревания rBST увеличило выход созревших ооцитов из фолликулов Ø менее 3 мм с 38% до 60% (P<0,05, χ2-test) и уровень бластоцист во всех экспериментальных группах, независимо от диаметра фолликулов (<3 мм: 7% против 15%, Р<0,05; >3мм -5 мм: 26% против 49%,Р<0,01; > 5мм-8 мм: 21% против 39%, Р<0,01, χ2-test). Модернизирована система дозревания ооцитов Bos Taurus, не завершивших фазу роста in vivo (ВСВ-ооциты), путем введения в среду дозревания ооцитов и культивирования эмбрионов 0,001% наночастиц высокодисперсного кремнезема (нВДК) при пролонгировании культивировании до 30 часов. При этом значительно возросла доля созревших ооцитов (65% против 51%, Р<0,05, χ2-test) и уровень развившихся из них эмбрионов (23% против 12%, Р<0,05, χ2-test).
Отчет по проекту № 18-016-00147 (РФФИ)
Просмотров: 1000
Отчет за 2018 год. В соответствии с целью и задачами проекта на 2018 г. исследования были направлены на выявление особенностей функционирования структурных компонентов овариальных фолликулов (ооцит, кумулюс, гранулеза) Bos Taurus и Sus Scrofa Domesticus, содержащих растущие (ВСВ-) или завершившие фазу роста (ВСВ+) ооциты, с целью создания системы культивирования, обеспечивающей «экстрафолликулярное доращивание» женских гамет и получение яйцеклеток с высоким уровнем фертильности. В результате сравнительного мониторинга показателей жизнеспособности и дегенерации хроматина (апоптоз, пикноз) в клетках гранулезы и кумулюса из фолликулов свиней и коров, содержащих ВСВ- или ВСВ+ ооциты, с использованием цитологического анализа, методов цитофлуориметрии (Annexin-тест) и TUNEL-теста впервые выявлены нижеследующие особенности. Завершение фазы роста ооцитов Sus Scrofa Domesticus сопровождалось значительным ростом доли гранулезных клеток из фолликулов с ВСВ+ ооцитами в состоянии апоптоза (11% против 7 %, Р<0,05), пикноза (9 % против 5 %, Р<0,05), некроза (5 % против 3 %, Р<0,05) и снижением уровня жизнеспособных клеток (85 % против 88 %, Р<0,05) по сравнению с вышеуказанными показателями в гранулезных клетках из фолликулов с ВСВ- ооцитами. Уровень апоптоза до культивирования в клетках кумулюса (TUNEL) ВСВ+ ооцитов коров не отличался от такового ВСВ- ооцитов и составил 1%. В процессе культивирования доля апоптотических клеток кумулюса ВСВ+ ооцитов достоверно возрастала по сравнению с таковой ВСВ- ооцитов и составляла, соответственно: 6% против 2% (24 часа, Р<0,01), 19% против 10% (30 часов, Р<0,05 ), 37% против 18% (36 часов, Р<0,001). Идентифицированы особенности гормонального статуса (содержание тестостерона, АМГ) в жидкости фолликулов (ЖФ, d=6-8мм) коров и свиней, содержащих ВСВ- или ВСВ+ ооциты. Выявлены видовые различия в гормональном профиле (пролактин и ФСГ) ЖФ коров и свиней, содержащих ВСВ+ или ВСВ- ооциты. Полученные данные свидетельствуют о возможности использования показателей уровня содержания АМГ, стероидных и гипофизарных гормонов в качестве биомаркера функционального состояния ооцитов (растущие, завершившие фазу роста). Впервые показано, что в ВСВ+ ооцитах свиней содержание депонированного кальция на всех этапах пролонгированного культивирования значительно превышало таковое в растущих ооцитах, что возможно детерминируется активизацией процессов, вовлеченных в завершение фазы роста. Выявлен положительный эффект рекомбинантного бычьего соматотропина на созревание и показатели оплодотворяемости (число дробящихся клеток и уровень развившихся эмбрионов на стадии бластоцисты) ооцитов коров, не завершивших фазу роста in vivo при пролонгации культивирования до 30 часов. Выход созревших ооцитов, тестированных на момент извлечения их из фолликулов, как ВСВ- при пролонгации культивирования составила 71% против 53% (24 часа культивирования, Р<0,05). Доля эмбрионов на стадии бластоцисты, развившихся из ооцитов, не завершивших фазу роста in vivo, при увеличении времени культивирования достигла 22% против 8% в контрольной группе (Р<0,05).
Если заметили ошибку, выделите фрагмент текста (побольше) и нажмите Ctrl+Enter
